中科院神經(jīng)科學(xué)研究所、腦科學(xué)與智能技術(shù)創(chuàng)新中心、神經(jīng)科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊輝研究組與蘇州非人靈長(zhǎng)類(lèi)研究平臺(tái)孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)合作，利用了一種以同源臂介導(dǎo)的末端接合（HMEJ）為基礎(chǔ)的基因敲入策略，在世界上獲得了基因敲入的食蟹猴。1月12日，這一重要研究成果以題為《運(yùn)用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)獲得基因敲入食蟹猴》在線發(fā)表于《細(xì)胞研究》期刊。
 
由于基因修飾猴模型可以用于模擬人類(lèi)疾病癥狀，因此它可以作為研究人類(lèi)疾病機(jī)制和推進(jìn)臨床治療的工具。然而， 由于普通猴具有繁殖周期長(zhǎng)(5-6年一代)，幼仔數(shù)量少（每胎一只）以及基因編輯效率低等特點(diǎn)，導(dǎo)致構(gòu)建靶向基因編輯猴具有很大的困難和挑戰(zhàn)性。zui近的一些研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以用于構(gòu)建基因敲除猴。然而，與基因敲除相反，由于種種原因例如效率低，到目前為止仍然還沒(méi)有基因成功敲入猴的報(bào)道。
 
基于實(shí)驗(yàn)室之前的研究，同源臂介導(dǎo)的末端接合（HMEJ）的方法可以有效地在獼猴胚胎上實(shí)現(xiàn)的靶向基因整合。研究人員進(jìn)一步優(yōu)化受精卵注入條件，包括供體質(zhì)粒濃度以及注射劑量，期望在提高敲入效率的同時(shí)保持正常的胚胎發(fā)育，進(jìn)而獲得基因敲入的猴子。具體來(lái)說(shuō)，研究人員在Actb (β-actin) 位點(diǎn)插入p2A-mCherry以實(shí)現(xiàn)mCherry在Actb啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。在經(jīng)歷完整的懷孕周期后，研究人員成功地獲得了一對(duì)雙胞胎猴（#1，雄；#2，雌）和三只單胎的雌性猴 (#3、#4和#5)。通過(guò)直接表皮熒光觀察兩只新生猴(#1，#5)的腳趾發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，#1和#5展現(xiàn)出mCherry熒光。對(duì)兩只死亡雌猴子(#2，#3)的各個(gè)組織進(jìn)行切片觀察，發(fā)現(xiàn)尾巴、腳趾、心臟、肌肉、心臟、腎、大腦和卵巢均顯示出不同嵌合程度的mCherry表達(dá)。值得注意的是，研究人員在卵巢的大部分區(qū)域都檢測(cè)到mCherry的表達(dá)，說(shuō)明基因敲入猴子具有生殖系傳遞的可能性。所有組織的PCR鑒定測(cè)序結(jié)果都表明在5’和3’連接處的整合是正確的。此外，Southern印跡分析進(jìn)一步證實(shí)# 2和# 3猴的基因整合是正確的且沒(méi)有額外的基因隨機(jī)整合。
 
”研究人員利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的HMEJ策略，通過(guò)一細(xì)胞胚胎注射成功地獲得了基因靶向整合的食蟹猴。”專(zhuān)家表示，基于其強(qiáng)大的DNA敲入效率和高保真性，HMEJ介導(dǎo)的敲入策略為構(gòu)建靶向基因修飾的猴模型提供了可能性。
 
據(jù)介紹，這項(xiàng)工作由助理研究員姚璇、博士后劉真與研究生王興在靈長(zhǎng)類(lèi)疾病模型研究組楊輝研究員與蘇州非人靈長(zhǎng)類(lèi)研究平臺(tái)主任孫強(qiáng)博士的指導(dǎo)下完成。并得到國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)， 中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專(zhuān)項(xiàng)， 國(guó)家高科技研發(fā)項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金會(huì)，  *重大突破項(xiàng)目、國(guó)家關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)項(xiàng)目， 上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)項(xiàng)目， 中科院百人計(jì)劃等項(xiàng)目的資助。