染色體熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)分析技術，是為了了解染色體熒光原位雜交分析技術的應用價值。染色體熒光原位雜交技術是一種重要的非放射性原位雜交技術，其基本原理是利用被檢測的染色體上的靶DNA與所用的核酸探針（probes）間的序列同源互補性，經(jīng)“變性→退火→復性”，形成靶DNA與核酸探針的雜交體。核酸探針既可以直接用熒光分子標記，也可以在先標記上報告分子如生物素、地gao辛，再使報告分子與熒光素標記的特異親和素或抗體發(fā)生免疫化學反應，后經(jīng)熒光顯微鏡對靶DNA進行定性、定量或相對定位分析。

實驗步驟：

[1].從體外培養(yǎng)的貼壁細胞準備的中期染色體標本：

A.細胞的培養(yǎng)、秋水仙素處理、低滲處理、固定處理。

B.載玻片用硫suan洗液浸泡放一夜，清洗烘干，在5%APTES-乙醇溶液中60℃處理3h，取出清洗，70℃干燥備用。

C.將固定后的細胞滴于APTES修飾的載玻片上,空氣干燥。

D.脫水：70%、90%和100%乙醇脫水，每次5min，空氣干燥。注意：室溫下玻片標本可保存數(shù)天到數(shù)周；若載玻片要長期保存，應在室溫下過夜使組織“老化”（aged），然后放入容器中，該容器密封于含干燥劑的塑料袋內(nèi)，-70℃保存。-20℃保存的玻片可在6個月內(nèi)使用；-70℃可保存一年以上；但標本一旦溶化，則不能在此冷凍。

[2].染色體標本變性及脫水：

A.載玻片靜置60℃烤箱孵育預熱。

B.變性液A在水浴中加熱至70℃。

C.將染色體標本載玻片浸入變性液A中，70℃作用2min。

D.脫水：立即將載玻片依次移入冰冷的70％、90％及100％乙醇中，各保持5min。空氣干燥玻片。

[3].探針雜交液的準備（10μl/片）：

A.10~20ng探針DNA和1~3μg鮭魚精DNA混合，熱塊干燥DNA。

B.DNA中加入6~7μl甲酰胺，懸浮DNA，保持30min。

C.DNA溶液中加入1μl20×SSC（終濃度2×SSC）、2μl硫suan葡萄糖（終濃度10%）、1μl250mM磷酸鈉（終濃度25mM）。保持30min。

D.75℃變性DNA探針5min。

[4].染色體標本的雜交：

A.將10μl含變性探針的雜交液加至載玻片的變性靶DNA上。

B.在雜交液液滴上小心地蓋上18×18cm的蓋玻片，避免壓入氣泡。

C.載玻片置于濕盒內(nèi)，37℃溫育放一夜。

D.雜交結(jié)束前，42℃水浴預熱漂洗液A，60℃水浴預熱漂洗液B。

E.載玻片移入42℃預熱的漂洗液A中，在42℃水浴中振蕩10min直至蓋玻片脫落。

F.載玻片移入另一份42℃預熱的漂洗液A中，振蕩5min，更換漂洗液A兩次，每次振蕩5min。

G.載玻片移入含60℃預熱的漂洗液B中，漂洗5min，更換漂洗液兩次，每次漂洗5min。

若DNA探針用熒光標記，則無需進行下列檢測步驟，可直接進行顯微鏡熒光觀察。

[5].染色體標本的檢測：

A.載玻片滴加50~200μl封閉液，22×40mm蓋玻片覆蓋，置濕盒內(nèi)，37℃溫育至少30min。取出載玻片，無菌水輕輕沖去蓋玻片。

B.用封閉液配制的檢測化合物溶液（1~20μg/ml）。如熒光素偶聯(lián)的鏈親和素（streptavidin），或抗地gao辛抗體（Anti-DIG-fluorescent-conjugate）溶液。

C.載玻片上滴加50μl含熒光標記分子的檢測液，22×40mm蓋玻片覆蓋，置濕盒內(nèi)，37℃溫育30min，或室溫放置1h。

D.取出載玻片，無菌水輕輕沖去蓋玻片；將載玻片移入漂洗液C中，42℃振蕩漂洗3次，每次5min。

[6].將載玻片置入含復染液中，室溫振蕩20min。

[7].將載玻片移入漂洗液C中，室溫溫育1~2min。

[8].載玻片上滴加10~50μl甘油封片液，22×40mm蓋玻片覆蓋，用潔凈指甲油封閉玻片。玻片在-20℃或-70℃暗處保存數(shù)天或數(shù)月。

注意事項：

[1].進行熒光物質(zhì)的實驗步驟時，采取避光措施。

[2].DAPI對人體有一定刺激性，請注意適當防護。

[3].原位雜交使用易透過細胞膜進入胞內(nèi)或核內(nèi)的寡核苷酸探針和短的PCR標記探針（80~150bp）。

[4].原位雜交中，無論應用何種標記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。

[5].適復性溫度：TOR=Tm–25℃。

[6].苛刻復性溫度：Ts=Tm–(10或15℃)

[7].非苛刻復性溫度：Tns=Tm–(30或35℃)