ELISA 的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。加入酶標記的抗原或抗體，通過反應也結合在固相載體上。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，根據呈色的深淺進行定性或定量分析。酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。

ELISA試劑盒雙抗體夾心法的操作步驟主要有以下幾個步驟：

1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃ 隔夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。 　　

2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。

3.加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。

4.加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

5.終止反應：于各反應孔中加入2M**0.05ml。

6.結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。