1、材料：
   生長良好之培養細胞、新鮮培養基、DMSO（Sigma D-2650）、無菌塑料冷凍保存管（Nalgene　5000-0020）、0.4％（w/v）trypan blue（GibcoBRL15250-061）、血球計數盤與蓋玻片、等速降溫機（KRYO10SeriesII）。
2、冷凍保存方法：
（1）傳統方法：冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16～18小時（或隔夜）→液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 
（2）程序降溫：利用已設定程序的等速降溫機以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。 
3、步驟： 
（1）冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀察細胞生長情形。 
（2）配制冷凍保存溶液（使用前配制）：將DMSO加入新鮮培養基中，zui后濃度為5～10％，混合均勻，置于室溫下待用。
（3）依細胞繼代培養之操作，收集培養之細胞，取少量細胞懸浮液（約0.1ml）計數細胞濃度及凍前存活率。
（4）離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標示*之冷凍保存管中，1ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。 
4、注意事項： 
（1）欲冷凍保存之細胞應在生長良好（logphase）且存活率高之狀態，約為80–90％致密度。
（2）冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。
（3）注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色（以0.22micron　FGLP　flon過濾或是直接購買無菌產品，如Sigma D-2650），以5～10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。
（4）冷凍保存之細胞濃度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml 
②hybridoma：1～3×106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后死去。 
③adherent tumor lines：5～7×106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1～3×106cells/ml 
④other suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml。 
（5）冷凍保護劑濃度為5或10％DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。