變性梯度凝膠電泳法(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)分析PCR產物,如果突變發生在zui先解鏈的DNA區域,檢出率可達100%,檢測片段可達1kb,zui適圍為100bp-500bp。基本原理基于當雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性溫度*的凝膠位置時,DNA發生部分解鏈,電泳遷移率下降,當解鏈的DNA鏈中有一個堿基改變時,會在不同的時間發生解鏈,因影響電泳速度變化的程度而被分離。由于變性梯度凝膠電泳法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測,需要一套的電泳裝置,合成的PCR引物在5`末端加一段40bp-50bp的GC夾,以利于檢測發生于高熔點區的突變。
原理:
變性梯度凝膠電泳系統(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)的原理是使用一對特異性引物,PCR擴增微生物自然群體的16s rRNA基因,產生長度相同但序列有異的DNA片段的混合物。然后用變性梯度凝膠電泳分離產物混合物。變性梯度凝膠電泳DGGE膠是在6%聚丙烯酰胺膠中添加線性梯度的變性劑,變性劑的濃度由上到下,從低到高成線性梯度。在一定溫度下,在同一濃度的變性劑濃度下,序列不同的產物,其部分解鏈程度也不同,而產物解鏈程度又直接影響其電泳遷移率,結果不同的產物在凝膠上分離開來。在引物的5’端加上40個堿基左右的G-C串可使變性梯度凝膠電泳DGGE對序列差異的分辨率提高到近100%。所以變性梯度凝膠電泳法可用于微生物群落結構的研究、微生物種群動態的分析、富集培養物及分離物的分析、核糖體RNA同源性的分析。但由于在PCR擴增過程中可能存在堿基插入的錯誤、不同微生物細胞破壁難易的不同等而造成分析結果的偏差。