RT-PCR實驗方法及其經驗總結
RT-PCR實驗有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：
1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不會出太大問題。
3. PCR，按常規。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。
1）RT和PCR時的引物設計是不是一定要先知道目的基因的序列？必須
在RT時，引物設計有3種方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特異的下游引物。如果用a和b方法，是擴增的所有的cDNA（理論上），還要用此產物做PCR 的模板繼續擴增。
如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？http://www.ncbi.nlm.nih.gov
問題：
在做RT-PCR遇到一怪現象，即對同一動物不同組織擴增同一段基因，結果從一種組織中可以擴出我的目的基因，條帶非常的好，而另一組織在同樣的條件下卻得到許多非特異性的條帶，嘗試其他條件同樣無法得到滿意的結果，百思不得其解！（注：已肯定該基因在兩種組織中都表達，且內參照在兩種組織都可擴增出來）
從這兩種組織中提取的RNA的量是不一樣的，我測過吸光度，差異還很大，會不會和這有關呢？ 請高手指教！
解答：
1.RT-PCR有兩種做法：
條件具備的話可用kit進行一步法進行；若條件不太好的話可分兩步進行逆轉錄再PCR。但后來發現兩步法的結果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現象，我推測是體系更加單一比較利于PCR的進行，當然也可能是我買的kit不太好。（promega）。
2.RT-PCR應具備的條件
高質量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（產物短點）；若涉及粗略定量的話還應考慮RNA的濃度或是cDNA的濃度（如果由內標分子更好，但我發現其實很不容易將RNA的濃度以及內標分子的表達量調整的*一樣）；體系的均一性等。
3.RACE
我做過RACE（3’RACE是寶生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但現在再進行另一個同源基因的3‘RACE時卻怎么也P不出來，這兩個基因是由同一對引物擴增出來的，其中一個已經獲得了全序列（RACE的方法），而另一個基因的3’UTR卻增么也擴不出來，我推測是不是該基因的3‘UTR太長的緣故，我都快綠了，有無
RT-PCR的常用內標b－actin 和GAPDH的使用有選擇性嗎？比如不同的細胞，不同的刺激。
有關內參：
RT-PCR內參照可以在一個管子里做（那樣也是圖好看一些），分開兩管，把除了引物之外的mixture統一配，拍照后，算目的基因和內參的比值，這就是基因表達的相對濃度。
問：我曾經作過同一管的PCR，內有actin 和目的基因引物。雖然可見到兩條均一條帶但圖片質量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。請教mxbdna2003 ，你是如何處理同一管的PCR的各成分的濃度？
答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using 'accurate piptte' is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.
在同一管中做RT，其實沒有什么問題，不需要taq魅加量，taq酶本來就是過量的^-^，（平時做pcr的時候，*可以再省一些taq酶的，半斤八兩就可以了，我想這肯定再很多貼子里應該都談到了。Mg就跟不能變了，一變整個體系就變了。能看到均一條帶就很好了。
關鍵是摸，（太少，只爭朝夕，開個玩笑）雖然用不著，但是摸上3、5摸總是必要的，首先遙分開摸，然后再一起摸，直到摸的好了，還要考慮比較的不同的模板中的量，所以我們不建議再同一管中進行，因為還有互相競爭抑制的問題，即使不同基因之間。
有關內參的建議：
一定要做內參的，每一次，我想。不作內參的結果是不可信的
電泳可以不一起跑，沒有關系，計算的是相對表達程度，著我在好幾封帖子里都談了，再說一邊我得觀點，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對表達量，不是表達量，除非你能準確知道來自多少細胞，但是細胞還有死的呢。2、以電泳為基礎的半定量RT-PCR本身是不可信的，作為實驗的粗篩是可以的，但不能作為zui終結果的，3、半定量RT-PCR應該再兩管中進行，除非內參基因和目的基因表達相同，長度差不多，GC含量相似，或者實在窮的要省PCR管和taq。
關于平臺期和線性期的問題，實際上線性期是指數期，只不過碰巧2的冥和2的倍數是相同的。看上去任何一個時期都可以，實際上是不對的，因為牽涉到酶促動力學的問題，這個我也不懂，有一些專門的文章，好像，涉及到很多化學的東西。我們學醫的，也沒必要知道那些，但是其中主要是因為模板引物酶原料和buffer之間的關系，這種反應單*改變其中一種成分沒有用的，酶一直是過量，再加酶也沒用，引物ntp都是這樣。煙鬼正傳，選線性期的開始階段，但是要在你的凝膠成像分辨范圍內，所以選一個這兩種的契合點。給你一張圖你就明白了，再開始的時候酸的是切線，這圖我在 *** 帖過。
關于引物設計，再可能的情況下，除了常規要求之外，兼顧跨內含子（不過，根據要求，還可以專門設計隔內含子的，這樣還可以用于基因組PCR）、長度小于500bp－600bp等等。
引物當然要設計成一樣的退火溫度，即使不再一管中，也要一樣的，要在一臺機器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一個溫度，這樣任何幾個都可以拿來披，也不用查。
我反復說過了，別用軟件，就用眼睛看，軟件涉及的在好，有些基因在它出軟件的時候，還沒發現呢，跟不要說在基因組的位置和序列了，怎么考慮內含子的問題呢？
18s的引物也和的βactin一樣是設計的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用總RNA為模板，但是比actin和bubulin等可準多了，更不要說GAPDH這個破爛了。18s除了在細胞中更相同（量）外，主要是它占的比例遠遠高于看家基因，所以定量更加準確，我想，不知對不對，請幾位主任和eeflying指教。我認為，就像你用某一種東西的數量去概括，因該選那種多的東西，說一座房子是由2000塊磚造成的，比說又29根梁更準確吧。更不要說沒有看家基因不看家的缺點，因為他是服務于整個基因組表達譜什么的。
PE有專門的用于實時PCR的內參試劑盒，就是用18s，不過我們看懂使用的那條序列，不知有沒有人用過，告知其序列和genbank號。
正好問一下，我查了一些序列，一直沒有去合成，主要是因為手上的actin的熒光探針還沒有完，當初和成了一堆。
有那位高手用過18s的內參，請問您的序列（我指的是模板的序列）？
原位雜交用RNA做探針，效果好一些，反正你有錢賣roche的盒子，而且量也能保證，因為轉錄過程嘛，沿著一條線突突地跑就是了。正義反義也容易理清。
我覺得做RT-PCR的方法和條件及應注意的事項就是那么幾條,許多專業書都有詳細的描述,但是許多人還是歷經多次磨難，有時就是得不出結果。因此，我認為因為每個人所要克隆的片斷不同，引物不同等，因此對不同的人來說還是有他自己的特殊性,我的以下經歷說明：做實驗時各人的情況不同,做不出時還是要好好動一下。
記得我開始我的ＲＴ－PCR時，按常規方法，提取總ＲＮＡ后，首先用自己設計的下游引物進行逆轉錄，不斷改變反應條件，進行了Ｎ次均沒有結果。后來考慮到本人的克隆的PCR的片斷位于我們實驗另一位同學克隆的片斷當中，而該同學已經用RT-PCR克隆出她的片斷（盡管她用這些ＲＴ－ＰＣＲ產物做模版再進行ＰＣＲ時也沒辦法重復出她的產物），因此，我先用她的引物和條件擴增出她的片斷，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ產物作模板（有點改進，逆轉錄反應換用了９mers隨機引物），用我的引進物進行一般PCR，終于得到我的產物，測序結果*正確。盡管我的這個經歷別人很人遇到，但足可以說明實驗可以有自己的模式，書本的知識和別人的經驗很重要，但有時也不定要受到書本框框和別人經驗的限制
請問：
1 引物的特異退火溫度怎樣設定？可以根據gc 和at含量算出嗎？可以用引物報告單上的Tm值嗎？
2 PCR時20微升體系中cDNA應加多少比較合適？MgCl2應加多少？各個成分的量有無確定標準？
3 PCR結果跑電泳，actin有，但跑不出目的條帶，有幾種原因？與cDNA的量少有關嗎？Mg離子太多是否會抑制Taqase的活性？
一般來說引物報告單傷得是對的,也可以自己算,實際上重要的各條引物一致,剩下的可以摸的.
20中是指體積還是量?只要不明顯改變體系的離子強度,加1,2ul都可以的.mg要調的,但我總覺得沒有書里講的那么玄乎,我都是常年不變的.
如果內參照有,目的沒有,至少證明不是'美麗惹'的禍.原因書里應該都說了.
在所有RNA實驗中，zui關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩定，一般反應不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。
在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要zui大限度地抑制內源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。
一、 防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用沖洗（注意：有機玻璃器具因可被腐蝕，故不能使用）。
3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。
4. 配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經0.22μm濾膜過濾除菌。
5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。
6. 設置RNA操作實驗室，所有器械等應為。
二、常用的RNA酶抑制劑
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不*的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團*的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。
2. 異硫氰酸胍：目前被認為是zui有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。
3. 氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能*抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。
mRNA的分離與純化
真核細胞的mRNA分子zui顯著的結構特征是具有5’端帽子結構（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數哺乳類動物細胞mRNA的3’端存在20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結構為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。
mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法zui為有效，已成為常規方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。
