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閱讀:676發(fā)布時(shí)間:2017-4-11
腫瘤細(xì)胞的軟瓊脂集落培養(yǎng)和測(cè)定
一、原理
在體外培養(yǎng)基中由一個(gè)祖先細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞團(tuán),稱之為集落。腫瘤細(xì)胞能無(wú)限繁殖,所以具有這種能力,而成熟分化的細(xì)胞則不能形成集落。HL一60細(xì)胞是一種急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞,在體外無(wú)需加刺激因子,可在軟瓊脂培養(yǎng)基中形成集落。二甲基亞砜是一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑,經(jīng)二甲基亞砜處理后的HL一60細(xì)胞按粒系途徑定向成熟分化,同時(shí)細(xì)胞的增殖力降低,幾乎全部細(xì)胞喪失了軟瓊脂中形成集落的能力。因此,這種方法可用于細(xì)胞分化的基礎(chǔ)研究和臨床*的療效檢驗(yàn)等方面。
二、操作
1.收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL一60細(xì)胞,先按實(shí)驗(yàn)十三測(cè)定細(xì)胞活力,然后調(diào)整細(xì)胞濃度,制成300~1000活細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。
2.取二個(gè)培養(yǎng)瓶每個(gè)瓶中加9ml調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液,然后各加入1ml 3%瓊脂(已融化,在65℃水浴中放置),迅速加入,混勻。
3.用微量加樣器吸140μl二甲基亞砜(MDSO),加到一個(gè)瓶中,充分混勻,為實(shí)驗(yàn)組,另一瓶不加DMSO,為空白對(duì)照組。
4.取一個(gè)16mm多孔培養(yǎng)板,每孔加1ml(35mm培養(yǎng)皿需加2ml)細(xì)胞瓊脂懸液,勿有氣泡,將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分兩組加好,蓋上蓋并作好標(biāo)記。
5.在室溫放置20分鐘使細(xì)胞瓊脂懸液凝固。
以上各步驟均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
6.然后移培養(yǎng)板或平皿于CO2培養(yǎng)箱中37℃進(jìn)行培養(yǎng)。
7.培養(yǎng)7~10天,肉眼觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞集落。
三、結(jié)果
以肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞團(tuán)(含500個(gè)以上細(xì)胞)作為計(jì)數(shù)集落的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組HL一60細(xì)胞在含0.3%的軟瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好,每個(gè)孔中可見(jiàn)有多個(gè)集落形成,而實(shí)驗(yàn)組HL一60細(xì)胞因經(jīng)二甲基亞砜誘導(dǎo)分化,細(xì)胞在軟瓊脂中的集落形成明顯減少。
四、集落的計(jì)數(shù)和計(jì)算
集落數(shù)=n孔中細(xì)胞集落數(shù)總和/n孔
集落形成率=集落數(shù)/接種培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)×100%
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