基于iTRAQ和磁珠分離技術的類風濕關節炎濕熱瘀阻證血清蛋白質組學研究
類風濕關節炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種以關節炎為主要表現的自身免疫性疾病,是導致殘疾的重要原因之一。在祖國醫學中RA屬于“痹病”、“白虎歷節”、“尪痹”的范疇,中醫藥對于RA的治療有著療效好、副作用低、個性化強、花費少的特點。濕熱瘀阻證是RA尤其是活動期RA的重要證型,清熱活血法是治療RA濕熱瘀阻證的主要治療方法。臨床的準確辨證是中醫臨床療效的保證,目前,在中醫的臨床診治中,辨證的多樣化、主觀化影響了臨床用藥的準確性。證候的規范化、客觀化研究一直是中醫學與現代醫學結合研究的重要方面,中醫學的“證”是人體病理狀態的反應,“證”的整體性、模糊性、動態性、差異性、復雜性的特點,使得中醫的“證”通過現代實驗室檢查所得到的單一微觀理化指標不能整體反應“證”的表達特點,并缺乏足夠的特異性。如何將中醫理論客觀量化一直是中醫學與現代醫學結合的一個巨大障礙,也是中醫學進入新的發展時期以來所面臨的一個瓶頸。以蛋白質組學為代表的系統生物學技術的出現使現代醫學由還原論思維走向了整體思維,也使得中醫的理念有了數理化的可能。蛋白質組學的整體性、復雜性、動態性、信息化的特點和中醫學的理念不謀而合。蛋白質組學技術在中醫證候學的研究中得到了廣泛的應用,并取得了一系列的成果,指導了中醫的臨床診治。然而在RA的研究中,尚無課題組以蛋白質組學的技術手段對RA濕熱瘀阻證進行深入探討。本課題采用病證結合的方法,將從探討濕熱瘀阻證的微觀物質基礎的角度出發,分別應用同位素標記相對和定量蛋白質組學技術(iTRAQ)結合超液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(UPLC-QE-MS)以及磁珠分離多肽技術結合基質輔助激光解吸串聯飛行時間質譜(MALDI-TOF/TOF-MS),尋找RA濕熱瘀阻證血清差異蛋白,研究差異蛋白應用于RA證候診斷的價值,為進一步的證候學研究提供參考依據。研究一基于iTRAQ技術的類風濕關節炎濕熱瘀阻證差異蛋白質組學分析研究目的:篩選RA濕熱瘀阻證差異蛋白,揭示其微觀物質基礎,為進一步研究疾病發病機制及臨床辨治提供依據。研究方法:本研究共納入病例90例,分為RA濕熱瘀阻證、RA非濕熱瘀阻證、健康志愿者三組,每組各30例,其中男性4例、女性26例;通過SPSS v 19.0軟件分析,采用H檢驗的方法統計得出各組間年齡無統計學差異,具有可比性。各組病例樣本血清分別進行混合后,采用同位素標記相對和定量蛋白質組學技術(iTRAQ)進行定量標記,再以超液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜(UPLC-QE-MS)進行分析檢測。所得質譜數據選用Thermo Proteome Discoverer 2.1軟件進行蛋白的檢索和鑒定,當篩選蛋白組間比較差異倍數≥1.5(上調)或者≤0.7(下調),且經統計檢驗q-value<0.05時,定義為組間差異蛋白。生物信息學分析采用DAVID數據庫(DAVID Bioinformatics Resources)對所鑒定的差異蛋白進行GO(Gene ontology)注釋、功能注釋聚類分析及KEGG Pathway通路分析,采用STRING數據庫對差異蛋白進行相互作用分析。研究結果:經與健康對照組比較分析,共得出RA濕熱瘀阻證差異蛋白72個,其中上調蛋白25個,下調蛋白47個,RA非濕熱瘀阻證中得出上調差異蛋白1個,下調蛋白11個,濕熱瘀阻證蛋白表達與非濕熱瘀阻證蛋白表達存在明顯差異。通過對濕熱瘀阻證上調蛋白GO注釋分析,其相關生物功能主要涉及急性期反應、Fc-gamma段受體信號通路介導的吞噬作用、受體介導的內吞作用、補體激活、血小板脫粒、補體激活經典途徑、血小板聚集、蛋白質水解、凝血及纖維蛋白凝塊形成9個方面,差異蛋白位置分布涉及10個方面,其中胞外區、細胞外間隙、胞外外泌體占到了 78%,主要參與了抗原結合、*肽鏈內切酶激活兩個生物學過程。濕熱瘀阻證下調蛋白相關生物學功能主要涉及26個方面包括補體激活的經典途徑、補體激活、受體介導的內吞作用、免疫反應的調節、蛋白質水解、免疫反應等方面;差異蛋白所處細胞位置主要分布于胞外區、胞外外泌體、細胞外間隙、血液微粒、細胞膜等12個方面;所參與生物過程包括抗原結合、*肽鏈內切酶激活、*結合、脂類結合等10個方面。在RA濕熱瘀阻證上調差異蛋白中有6個蛋白表達與急性期炎癥相關,分別為血清淀粉樣蛋白A1(SAA1)、αl-酸性糖蛋白(AGP1)、觸珠蛋白(HP)、α2-酸性糖蛋白(AGP2)、血清淀粉樣蛋白A4(SAA4)及C反應蛋白(CRP);有IGHG3、IGHV1-69、IGHV4-34、IGHL7-43 4個免疫球蛋白片斷表達與補體激活相關;有3個蛋白表達與血小板聚集、凝血、纖維蛋白凝塊形成相關,分別為肌動蛋白β(ACTB)、纖維蛋白原α鏈(FGA)、纖維蛋白原γ鏈(FGG);另外FGA、FGG、AGP1、AGP2還與血小板脫粒相關。這提示RA濕熱瘀阻證與急性炎癥反應及凝血功能的異常密切相關,在對濕熱瘀阻證上調蛋白相關Pathway通路的分析中存在Coagulation and complement cascades、Bacterial invasion of epithelial cells、Shigellosis、Plaet activation通路的激活。在濕熱瘀阻證差異蛋白表達中17個蛋白有文獻支持與RA存在直接相關性參與了 RA的發病。研究結論:通過濕熱瘀阻證、非濕熱瘀阻證與健康對照組的對照,從整體上得出了一系列差異蛋白的表達,在濕熱瘀阻證差異蛋白表達中急性期炎性蛋白、凝血相關蛋白占重要地位,體現出RA濕熱瘀阻證與疾病的活動性存在重要,與現代醫家對于濕熱證的研究具有一定的相似性,也為清熱活血法治療RA提供了一定的參考依據。以iTRAQ技術篩選差異蛋白的表達,對于研究RA濕熱瘀阻證的客觀物質基礎有一定的價值,我們不能簡單的將濕熱證等同于炎性蛋白的表達,但通過這一系列的差異蛋白,使我們在接下來的研究中有了更多的研究方向去探索RA及濕熱瘀阻證的發病機制,在治療方面,進一步研究中醫方藥干預對于疾病中蛋白表達的影響,無論對于研究疾病的發病機制還是對于辨證用藥的化都具有重要意義。研究二基于磁珠分離技術的類風濕關節炎及濕熱瘀阻證血清多肽質譜分類模型的建立及驗證研究目的:建立RA血清多肽分類模型及RA濕熱瘀阻證血清多肽分類模型,為臨床診斷提供依據。研究方法:本研究共納入RA患者40例,其中濕熱瘀阻證20例、非濕熱瘀阻證20例,每組男性2例、女性18例,納入健康對照組20例,其中男性2例、女性18例。通過SPSS v 19.0軟件分析,采用H檢驗的方法統計得出各組間年齡無統計學差異,具有可比性。分別以RA患者40例與健康對照組20例進行比較建立RA血清多肽分類模型,以RA濕熱瘀阻證患者20例與非濕熱瘀阻證患者20例比較建立RA濕熱瘀阻證分類模型。研究采用磁珠分離法提取樣本血清多肽,所得樣本多肽經點靶干燥后,以基質輔助激光解吸串聯飛行時間質譜(MALDI-TOF/TOF-MS)進行檢測,質譜數據以 Clinprotools 3.0 軟件(CPT3.0)進行分析建立疾病分類模型。再次納入RA患者20例,包括濕熱瘀阻證10例、非濕熱瘀阻證10例,健康對照組10例,其中以RA患者20例與健康對照組10例進行RA血清多肽分類模型;以濕熱瘀阻證10例與非濕熱瘀阻證10例進行RA濕熱瘀阻證血清多肽分類模型驗證。樣本血清處理方法同上,將數據調入CPT軟件計算模型的準確率。研究結果:RA血清多肽分類模型通過GA-5算法所建立分類模型為分類模型,由五個多肽組成,其m/z分別為2601.05、4967.6、6639.43、1866.29、8144.63該模型中m/z4967.6、6639.43、8144.63多肽峰經統計學分析組間差異P<0.000001,其中m/z4967.6、6639.43的多肽峰表達強度與RA呈正相關,m/z8144.63的多肽峰表達強度則與RA呈負相關。該模型識別率為94.74%,交叉驗證率為81.96%,盲法驗證準確率為97.5%。m/z4967.6、6639.43的多肽峰具有作為RA診斷血清敏感蛋白的潛在可能。RA濕熱瘀阻證血清多肽分類模型由GA-7算法所建立分類模型為分類模型,由五個多肽組成,其m/z分別為5740.43、4251.35、2863.03、1607.22、4531.5,其中 m/z5740.43 的多肽峰經統計學分析組間差異P<0.000001,且表達強度與RA濕熱瘀阻證呈正相關,該模型識別率為97.50%,交叉驗證率為80.05%,盲法驗證準確率為90%,m/z 5740.43的多肽峰具有作為RA濕熱瘀阻證血清敏感蛋白的潛在可能。研究結論:本研究所建立的診斷指紋圖譜模型準確率較高,對RA及RA濕熱瘀阻證的臨床診斷具有一定的參考價值,為進一步篩選其生物學標志物并研究疾病的發病機制打下基礎。
