ELISA試劑盒實驗操作步驟解析
一、樣品的保存
用于ELSIA檢測的樣本非常廣泛，包括各種動物組織、動物體液以及其他食品提取物等。有些樣本可以直接通過簡單離心、稀釋，有些則需要經過理化方法進行提取。檢測樣品應保證新鮮，經前處理的提取液應及時進行檢測，時間越長，提取液中的抗原的效價越低。如不及時檢測，應及時放4℃冰箱保存。防止細菌污染，因菌體中可能含有內源性HRP，可能會導致假陽性反應。如在冰箱中保存過久，其中的HRP可能發(fā)生聚合，在間接法ELSIA檢測中可使本底加深。所以標本如需保存做多次檢測，宜采用少量分裝冰箱保存。組織樣本若不及時做處理，應該放置-15℃冰箱保存。
二、試劑的準備
嚴格按照試劑盒的說明書的要求準備好需要用到的試劑。LEISA檢測中應采用蒸餾水或者去離子水，洗滌用水應新鮮和高質量，注意查看是否需要和洗滌液進行稀釋。自配的緩沖液應用PH計測量校正。從冰箱取出的試劑必須與室溫平衡方可使用。試劑盒中本次試驗不需要的試劑部分及時放回冰箱保存。
三、加樣
在ELSIA加樣步驟中，應加所加物加到ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。加標本一般使用微量加樣器，按規(guī)定的量加入孔板中。每次加標本必須更換槍頭，以免交叉污染。加酶標記物和底物液時可用定量多道加樣器，使加樣過程迅速完成。
四、溫育
溫育的方式一般采用水浴，可將酶標板置于水浴箱中，酶標板底貼著水面，是溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，酶標板上應加蓋，也可用塑料貼封或者保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。若保溫箱，酶標板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性能良好的材料或者如金屬等，在盒底墊濕的紗布，將酶標板放在紗布上。這樣能保證穩(wěn)定迅速平衡。無論水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫要嚴格限制在室溫的范圍內，標準室溫溫度是指20℃-25℃，具體的操作時間根據(jù)說明書的要求嚴格控制溫育。
五、洗滌
洗滌在ELISA過程中雖然不是一個反應步驟，但是卻決定著實驗的成敗，ELSIA反應就是靠洗滌來達到將游離和結合的酶標記物分離的目的。通過洗滌來清洗掉殘留在酶標板是未能與固相抗原或抗體結合的物質，已經在反應過程中非常特異性地吸附于固相載體上的干擾物質。聚苯乙烯等塑料材料對蛋白質的吸附石普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來?？梢哉f在ELSIA操作過程中，洗滌是主要的關鍵技術，每一次清洗都必須謹慎進行，操作者應嚴格按照要求進行洗滌。清洗的方式有手工清洗和洗板機自動清洗兩種。下面主要介紹手工清洗方式。
1、吸干或者甩干孔內反應液
2、用洗滌液洗一遍。（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）
3、浸泡，將洗滌液注滿酶標孔，放置1-2min，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短。
4、甩掉孔內液體，用清潔毛巾或者吸水紙拍干。
5、重復3和4步驟，洗滌4次。
六、顯色和比色
顯色是ELSIA中的zui后一個溫育步驟，此時酶催化無色底物生產有色產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的zui重要的因素。加入底物后的反應時間和溫度應該按規(guī)定嚴格控制準確。
七、酶標儀讀板
測讀吸光度值時，要選用產物的敏感吸收峰。有的酶標儀可用雙波長讀數(shù)，即每孔先后讀兩次，*次在波長，第二次在不敏感的波長，兩次測讀不移動酶標板的位置。zui終讀數(shù)得到值為兩者之差，即敏感波長值減去不敏感波長值。雙波長讀數(shù)可以減少由容器壁劃痕或指紋造成的光干擾。
八、結果判定
根據(jù)實驗讀數(shù)，結果產品說明進行結果判定。
