增加RT-PCR特異性的辦法
*鏈cDNA合成的起始可以使用三種不同的方法，各種方法的相對特異性影響了所合成cDNA的量和種類。
隨機引物法是三種方法中特異性zui低的。引物在整個轉(zhuǎn)錄本的多個位點退火，產(chǎn)生短的，部分長度的cDNA。這種方法經(jīng)常用于獲取5'末端序列及從帶有二級結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。為了獲得zui長的cDNA，需要按經(jīng)驗確定每個RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應(yīng)體系。因為使用隨機引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA，所以模板一般選用 poly(A)+RNA。
Oligo(dT)起始比隨機引物特異性高。它同大多數(shù)真核細胞mRNA 3'端所發(fā)現(xiàn)的poly(A)尾雜交。因為poly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2％，所以與使用隨機引物相比，cDNA的數(shù)量和復雜度要少得多。因為其較高的特異性，oligo(dT)一般不需要對RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進行優(yōu)化。建議每20μl反應(yīng)體系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18適用于多數(shù)RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因為其熱穩(wěn)定性較好，適用于較高的保溫溫度。
基因特異性引物（GSP）對于逆轉(zhuǎn)錄步驟是特異性的引物。GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機引物或 oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用于設(shè)計PCR引物的規(guī)則同樣適用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)GSP的設(shè)計。GSP可以同與mRNA3'zui末端退火的擴增引物序列相同，或GSP可以設(shè)計為與反向擴增引物的下游退火。對于部分擴增對象，為了成功進行RT-PCR，需要設(shè)計多于一個反義引物，因為目的RNA的二級結(jié)構(gòu)可能會阻止引物結(jié)合。建議在20μl的*鏈合成反應(yīng)體系中使用1pmol反義GSP。
提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度
為了充分利用GSP特異性的全部優(yōu)點，應(yīng)該使用有較高熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶。熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶可以在較高溫度保溫以增加反應(yīng)嚴謹性。比如，如果一個GSP退火溫度為55℃，那么如果使用AMV或M-MLV在低嚴謹性的37℃進行逆轉(zhuǎn)錄，GSP所帶有的特異性就沒有*利用。然而SuperScripⅡ和 ThermoScript可以在50℃或更高進行反應(yīng)，（表2）這就會消除較低溫度時產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物（圖10）。為獲得zui大的特異性，可以將RNA/ 引物混合物直接從65℃變性溫度轉(zhuǎn)移到逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，并加入預熱的2×反應(yīng)混合液（cDNA合成熱啟動）。這有助于防止低溫時分子間堿基配對。使用 PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度轉(zhuǎn)換。
使用ThermoScript™和設(shè)計用來同人DNA聚合酶εmRNA退火的GSP，由1μg Hela RNA合成cDNA。Thermoscript加入到預熱的反應(yīng)混合液中，使用Platinum Taq DNA聚合酶對1/10的cDNA進行35個循環(huán)的PCR。
減少基因組DNA污染
RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中沾染的基因組DNA。使用較好的RNA分離方法，如Trizol Reagent，會減少RNA制備物中沾染的基因組DNA。為了避免產(chǎn)生于基因組DNA的產(chǎn)物，可以在逆轉(zhuǎn)錄之前使用擴增級的DNaseⅠ對RNA進行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鐘以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子，防止高溫時所發(fā)生的依賴于鎂離子的RNA水解。
為了將擴增的cDNA同沾染的基因組DNA擴增產(chǎn)物分開，可以設(shè)計分別同分開的外顯子退火的引物。來源于cDNA的PCR產(chǎn)物會比來源于沾染的基因組 DNA的產(chǎn)物短。另外對每個RNA模板進行一個無逆轉(zhuǎn)錄的對照實驗，以確定一個給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉(zhuǎn)錄時所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。
