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細胞培養是體外研究細胞生物學性狀、遺傳學及分子生物學特性zui直接有效的手段。培養細胞遺傳學的主要檢測技術,包括性染色體的檢測、染色體顯示、染色體顯帶及染色體基因定位等。對培養細胞的分子生物學檢測主要包括細胞DNA檢測、RNA檢測及蛋白質的檢測,而相關的生物學檢測主要包括細胞酶學檢測及細胞凋亡的檢測。
組織培養細胞是研究細胞遺傳zui便利、zui有效的方法和對象;也是揭示培養細胞性狀的重要方面。*具有46條染色體數就是用細胞培養法所確定出來的。當前已發展出染色體分帶、姊妹染色單體分化染色、染色體原位雜交等多種技術。近年染色體熒光基因標記法又獲得迅速發展,使基因作為實體得以在染色體上顯現,從而*了染色體和分子遺傳學之間的空白。染色體的研究已成為組織培養技術中重要組成部分。
一、性染色體檢測
(一)原理
在間期細胞核中,女性x染色質和男性Y染色質均可用特殊染色法顯示出來。女性的兩個x染色體中的一個,在間期時的染色質呈異固縮(heteropycnosis),呈深染的小體稱Barr氏體(圖9—1)。Barr氏體位于問期細胞核內面,呈三角形或半月形小體,易為碳酸復葒等染料著色。正常女性Barr氏體陽性,男性為陰性。男性Y染色質位于間期細胞核近*部,易為鹽酸阿的平著色,熒光顯微鏡下觀察發較強熒光,呈點狀小體,發光部分系Y姿色體異固縮的長臂。初代培養細胞和二倍體細胞株均可觀察到性染色質,傳代細胞系表現不規律。
(二)方法
1.碳酸復紅(basic fuchsin)顯示x染色質法
(1)材料:蓋玻片培養的細胞。
(2)染色液
儲存液:稱堿性復紅3g,溶于1OOml 70%乙醇中,可長期保存。
工作液:(現用現配)
儲存液 10.0ml
5%石炭酸水溶液 90.0ml
冰醋酸 10.0 ml
甲醛(40%) 10.0ml
(3)染色步驟
1)細胞:蓋玻片培養細胞用37℃的BSS漂洗后,立即投入染色液內染色5~lOmin(亦可先固定再染色);如用涂片標本則應待涂片干后,迅速投入96%酒精固定10~15min后再染色。
2)分化:用96%酒精分化lmin,分化時要不斷搖動,把片子上多余的染料漂洗掉。
3)脫水:通過純酒精lmin。
4)封片:二甲苯透明2~3min,樹膠封固。
(4)結果:細胞質不著色,細胞核染成紫紅色;陽性Barr氏體附于細胞核膜內面呈三角或半月形小體。
2.熒光染色顯不Y染色質法
(1)材料:蓋玻片培養的細胞。
(2)染色液
PBS(pH5.5~6.6) 100.0ml
鹽酸阿的平(atebrine) 0.2g
(3)染色步驟:Y染色質顯示染色與染色體熒光顯帶法相同。
(4)結果:在熒光顯微鏡下觀察,Y染色質呈特別明亮黃綠色熒光圓點,直徑0.25~ 0.3μm,可位于核內任何位置,但以近*時居多。
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