FerroFarRed 亞鐵離子熒光探針,也稱為SiRhoNox-1、ER-SiRhoNox,是一種特異性檢測不穩定的鐵(II)離子(Fe2+)的熒光探針。FerroFarRed基本無熒光,一旦與Fe2+反應后,不可逆的生成一種遠紅熒光產物(Absmax=646nm,FLmax=662nm,圖1. FerroFarRed的光譜特征)。
FerroFarRed (Fe2+indicator) 亞鐵離子熒光探針
產品標簽
FerroFarRed;FeRhoNox-1;FerroOrange;Labile ferrous ion 不穩定鐵(II)離子;Fe2+熒光探針Ferroptosis 鐵死亡;C11 BODIPY 581/591 脂質過氧化探針;
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 價格(元) |
FerroFarRed (Fe2+ indicator) 亞鐵離子熒光探針 | MX4580-50nmol | 50nmol | 2480 |
FerroFarRed (Fe2+ indicator) 亞鐵離子熒光探針 | MX4580-100nmol | 100nmol | 4580 |
FerroFarRed (Fe2+ indicator) 亞鐵離子熒光探針
| MX4580-50nmol-S
| 50nmol-S
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產品描述
FerroFarRed,也稱為SiRhoNox-1、ER-SiRhoNox,是一種特異性檢測不穩定的鐵(II)離子(Fe2+)的熒光探針。FerroFarRed基本無熒光,一旦與Fe2+反應后,不可逆的生成一種遠紅熒光產物(Absmax=646nm,FLmax=662nm,圖1. FerroFarRed的光譜特征)。生理濃度下的鐵(III)離子(Fe3+)或其它除鐵離子以外的二價金屬離子都不會使其熒光增強(見圖2. FerroFarRed的金屬離子反應特異性)。FerroFarRed具細胞膜滲透性和高選擇性,且在高達100μM的濃度下對細胞幾乎無毒性,適用于活細胞內Fe2+的檢測,傾向定位在內質網(ER)。適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、熒光酶標儀以及流式細胞儀(配置紅色激光器)分析。
圖1.FerroFarRed的光譜特征。FerroFarRed在0.05M HEPES buffer,pH 7.4下的吸收光譜(左)和熒光光譜(右)。FerroFarRed的吸收波長在646nm,而熒光波長在662nm。
圖2.FerroFarRed的金屬離子反應特異性。FerroFarRed(5 μM)與各種金屬離子反應后,用熒光酶標儀測定熒光強度(激發波長:630nm,發射波長665nm)。可見,僅與Fe2+反應后發生顯著的熒光增強。
保存與運輸方法
保存:≤-20℃避光干燥保存,至少1年有效。
運輸:冰袋運輸。
注意事項
1) FerroFarRed傾向定位在內質網,但也可能檢測細胞質池內的Fe2+,目前針對這一點未做明確評估。
2) 熒光染料均存在淬滅問題,請盡量注意避光,以減緩熒光淬滅。
3) 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明
一、 需要自行準備的材料
1.1 細胞培養級或超純DMSO(比如:MS4601A-100ML)【強烈建議將高純的DMSO分裝成單次用量保存在極低溫冷凍室內,比如-80℃,避免吸潮。降解的DMSO可能會增加FerroFarRed的背景信號】
1.2 合適的觀察緩沖液(比如:PBS, pH 7.4;HBSS;等)。不要含酚紅。
1.3 無血清細胞培養基(D-MEM等)
二、探針準備
2.1從冰箱取出FerroFarRed,置于室溫回溫至少30min,將其置于微量離心機內低速離心。將瓶內的粉末離心到管底后,再開蓋。
2.2 往一管FerroFarRed(50nmol)內加入50μl 高質量DMSO,用槍反復吹吸5次或以上,使其完quan溶解即得到1mM FerroFarRed儲存液。【注意:FerroFarRed是藍色固體,但溶液幾乎無色(淺藍色)】。建議單次用完儲存液,若實在用不完,請根據單次用量分裝,置于-80℃避光保存。用中性緩沖液來稀釋儲存液。
三、HeLa細胞Fe2+的染色步驟(熒光成像分析)
3.1 在玻底培養皿內接種細胞,培養過夜。
3.2從培養皿內吸走培養基,用合適的觀察緩沖液(比如:HBSS)清洗兩次。
3.3 用無血清細胞培養基稀釋1uM FerroFarRed儲存液,制備成5mM的染色工作液。
3.4 將染色工作液加入培養皿內,于37℃孵育1h。
【注意:①建議根據細胞類型和自身實際需求優化工作濃度和孵育時間。②如果細胞很容易從培養皿上脫落,建議使用多聚L-賴氨酸或其它包被基質包被的培養皿來接種細胞。】
3.5 染色后用觀察緩沖液(比如:HBSS)清洗一次,替換成新的觀察緩沖液。
3.6 在熒光顯微鏡下觀察細胞。
四、HepG2細胞Fe2+的測定(流式分析)
4.1 于多孔培養板內接種細胞,過夜培養。
4.2 從培養板內吸走培養基,用合適的觀察緩沖液(比如:HBSS)輕輕的清洗兩次。
4.3 用無血清細胞培養基稀釋1uM FerroFarRed儲存液,制備成5mM的染色工作液。
4.4 將染色工作液加入培養板內,于37℃孵育1h。
【注意:建議根據細胞類型和自身實際需求優化工作濃度和孵育時間。】
4.5 染色后,用PBS清洗一次,之后加入0.25% yi酶-EDTA消化細胞。
4.6 于冰上用PBS稀釋0.25% yi酶-EDTA,之后500 x g離心細胞懸液5min,以沉淀細胞。
【注意:不可用血清來中和yi酶。】
4.7 吸走上清,用PBS重懸細胞。
4.8 用細胞篩網(40μm尼龍篩網)過濾細胞,去除細胞碎片。
4.9 上機,流式細胞儀分析。
五、熒光檢測
對于激光激發:635nm波長左右的激光器比較適合。熒光在660nm左右觀察。
對于熒光顯微鏡觀察:選擇檢測Cy5的紅色激發濾片。對于流式分析,選擇檢測APC的濾片。
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貨號 | 名稱 | 規格 |
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FerroFarRed的染色示例(來自文獻)
Ref 1. Li Z, Jiang L, Chew SH, et al. Carbonic anhydrase 9 confers resistance to ferroptosis/apoptosis in malignant
mesothelioma under hypoxia. Redox Biology. 2019 Sep;26:101297. DOI: 10.1016/j.redox.2019.101297. PMID:
31442913; PMCID: PMC6831888.
檢測方法(Fe(II)的細胞定位):Catalytic Fe(II) was detected with a fluorescent turn-on probe, SiRhoNox-1 (FerroFarRed;), as previously described. Cells (5?×?104) were cultured in normoxia on 35-mm glass bottom dish for 16?h?at 37?°C. After treatment with CA9 inhibitors under hypoxia for 48?h, cells were co-stained with 5?μM of SiRhoNox-1 and 200?nM of LysoTracker Green in FluoroBrite DMEM for 30?min?at 37?°C in normoxia, followed by incubation with 75?nM of MitoTracker Red for another 30?min. We confirmed that 1-h incubation in FluoroBrite DMEM containing 0.1?mg/L (0.25?μM) Fe(NO3)3 scarcely affects iron metabolism of the cells within this limited period. Medium was replaced with new FluoroBrite DMEM, followed by observation with a confocal microscope (LSM880, Carl Zeiss; Oberkochen, Germany). The excitation/emission used for SiRhoNox-1, LysoTracker and MitoTracker probes were 633/670, 504/511 and 579/599?nm, respectively. Local signal intensity of the regions overlapped with each organelle-trackers were analyzed with ZEN Imaging Software (Carl Zeiss).
Fig. 1 CA9 overexpression in MM cells correlates with increased catalytic Fe(II) in response to hypoxia. (F) Differential levels of catalytic Fe(II) in normoxia or hypoxia of ACC-Meso-1?cells were determined by staining with SiRhoNox-1 (5?μM), followed by evaluation with a flow cytometer after 48 h-incubation. (G) Localization of catalytic Fe(II) in normoxic or hypoxic ACC-Meso-1?cells were analyzed by co-staining of SiRhoNox-1 (5?μM), LysoTracker (200?μM) and MitoTracker (75?μM) after 48 h-incubation and observation with a confocal microscope. Integrated intensity per cell (N?=7) was quantified by ZEN Imaging Software (ZEISS) (means ± SEM; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P<?0.001 vs each control unless indicated by bar). Refer to text for details. SM, sarcomatoid mesothelioma; EM, epithelioid mesothelioma; N, normoxia; H, hypoxia; A.U., arbitrary unit.
— —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】
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