Stable Chemically Competent Cell 大腸桿菌化學感受態細胞

產品標簽：

Stbl3；Stbl2；HB101；Stable；Direct repeats 直接重復片段；Lentiviral expression vectors 慢病毒表達載體；Gibson Assembly 一步法克隆檢測試劑盒；

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產品組分：

菌株描述

Stable菌株是NEB公司開發的高轉化效率的大腸桿菌菌株，特別適合分離含重復元件和不穩定插入序列的質?？寺?，也適合分離和擴繁逆轉錄病毒/慢病毒載體克隆。與商業化的同源重組反應體系比如NEBuilder HiFi DNA Assembly，Gibson Assembly反應體系和酶切連接體系都兼容。Stable菌株基因型與Stbl2，Stbl3沒有關聯性，但具有更優異的性能（見圖1）?；蚪M含有重組酶recA1 relA1突變，能有效抑制長末端重復序列的重組，降低了錯誤重組的頻率。還含有核酸酶內切酶endA1突變，避免了質粒提取過程中核酸酶的污染，顯著提高制備質粒的產量和質量?；蚪M含有lacZΔM15，適用于藍白斑篩選。菌株本身含鏈霉素和四環素抗性，在成功轉化后賦予其額外的篩選標志。

Stable菌株基因型：F' proA+B+ lacIq ?(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) ?(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ?lacX74 galK16 galE15 e14-  Φ80dlacZ?M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rph spoT1 ?(mrr-hsdRMS-mcrBC

菌株亮點

◇   Stable菌株具有很高的轉化效率，經pUC19檢測轉化效率＞5×10⁸ cfu/μg DNA；

◇   Stable菌株是基因克隆進入腺病毒/慢病毒載體的推薦宿主菌；

◇   Stable菌株是克隆正向重復序列和反向重復序列的推薦宿主菌；

◇   Stable菌株含recA1突變，能減少克隆DNA的重組發生，從而降低錯誤重組頻率；

◇   Stable菌株含mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，能有效轉化真核來源的甲基化DNA或PCR、cDNA和許多其他來源的非甲基化DNA;

◇   Stable菌株含endA1（非特異核酸內切酶I）突變，確保得到zui高質量和產量的質粒；

◇   Stable菌株含fhuA突變，具有對噬菌體T1的抗性；

◇   Stable菌株含lacZΔM15，適用于具α-互補載體的藍白斑篩選；

產品描述

本品是Stable菌株經特殊工藝制作所得的感受態細胞，可用于DNA的熱擊轉化。經pUC19質粒檢測轉化效率＞5×10⁸ cfu/μg DNA。且在-80℃能穩定保存幾個月轉化效率不發生改變。

Stable與Stbl3克隆性能（錯誤重組率）的比較

圖1. Stable與Stbl3克隆不穩定DNA序列的性能比較。pUC-5xREP含5 x 32bp 重復序列，其在普通大腸桿菌中很不穩定。酶切后線性化的pUC19片段2.2ng+1ng 5xREP DNA段配制成重組反應體系，重組反應完成后分別轉化Stable感受態細胞（A）或Stbl3感受態細胞（B），復蘇60min，涂布在含50μg/ml羧芐青霉素的LB平板，30℃培養20h。之后做菌落PCR，檢測5xREP DNA插入的穩定性（含有正確插入片段的克隆，菌落PCR片段為623bp）。

注意事項

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在無菌條件的標準下進行】【詳見MKBIO內容】

附表1 固體和液體LB培養基配方

附表2 固體和液體SOC培養基配方

附錄1. Stable感受態細胞常見問題【詳見MKBio內容】

1.      Stable菌株的基因型和各基因賦予菌株的特征？

Stable基因型：F' proA+B+ lacIq ?(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) ?(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ?lacX74 galK16 galE15 e14-  Φ80dlacZ?M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rph spoT1 ?(mrr-hsdRMS-mcrBC

◇   藍白斑篩選（Φ80 Δ(lacZ)M15）：使得β-gal omega段。lacX74去除染色體上的β-gal基因。pUC19和相似基因編碼β-半乳糖苷酶（lacZ）的α肽。α肽與β-半乳糖苷酶的omega段（由F'攜帶，α-互補）結合。當β-半乳糖苷酶按照這種方式重新組合后能正常表達并切割X-gal生成藍斑。當克隆DNA進入質粒破壞α肽基因，使得菌落為白斑。

◇   重組缺陷（recA1）：大腸桿菌（E. coli）本身具修復系統能重組同源序列?；蚪M克隆通常有復制區，recA介導的重新排列不確定，特別當同源序列長于50bp。recA功能缺失的菌株比recA⁺菌株通常更緩慢生長。

◇   內切酶I缺陷（endA1）：野生型大腸桿菌的周質空間含非特異性內切酶。從這些菌株中制備質粒特別要注意質粒被降解。endA突變去除這個基因，顯著改善了質粒制備物的質粒。

◇   限制缺陷（Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)）：野生型大腸桿菌K12菌株含限制性內切酶，能切割含位點(AAC(N6)GTGC和GCAC(N6)GTT的DNA。雖然大腸桿菌DNA自身受保護，不被同源甲基轉移酶所降解，但外源DNA會在這些位點被切割。限制缺陷刪減了甲基轉移酶和內切酶的基因。

◇   甲基限制缺陷（mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)）：大腸桿菌具有一套酶系統，mcrA，mcrB和mrr能夠切割在高等真核生物和某些植物、細菌菌株發現的甲基化DNA。來自PCR擴增片段，cDNA或原先在大腸桿菌內擴繁的DNA不會被甲基化，也不會被切割。

◇   T1噬菌體抗性（fhuA）：T1，一種烈性噬菌體需要大腸桿菌羥肟酸鐵吸收受體用來感染。這個基因的刪減賦予對這個噬菌體的抗性，且不會顯著影響轉化或細胞的生長特征。

2.      Stable感受態細胞能替換Stbl2或Stbl3嗎?

答復：是的

3.      Stable感受態細胞適合大質粒轉化？

答復：是的

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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Stable化學感受態細胞（熱激法） Stable化學感受態細胞（熱激法） ?