大鼠肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白Aelisa試劑盒

【實驗準備】：
1. ELISA試劑盒及待測樣本
2. 酶標儀(450nm波長濾光片)
3. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭
4. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水
5. 吸水紙
【標本要求】：
1.血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
2.血漿：
應根據(jù)標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成應再次離心。
3.尿液：
用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。
4.細胞培養(yǎng)上清：
檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。
5.培養(yǎng)細胞:
檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
6.組織標本:
切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨笕匀槐３?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），或組織蛋白萃取試劑, 用手工或勻漿器將標本勻漿化。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
7.標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融
8.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
 
 大鼠肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白Aelisa試劑盒
【操作步驟】：
標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，依次進行稀釋數(shù)倍。
加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  
配液：將30倍（48T 的20 倍）濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
溫育：操作同3。
洗滌：操作同5。
顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.
終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
 
【計算結(jié)果】：
      以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
 
【注意事項】：
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，*使用排槍加樣。
4．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
 
 
【操作事項】：
1. 試劑準備：所有試劑都必須在使用前達到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。 實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2.  加樣：加樣或加試劑時，請注意在吸取標本 / 標準品，酶結(jié)合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預孵育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，*使用多道移液器加樣。
3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài);同時應嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。
4.   洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標儀讀數(shù)。
5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請精確配置標準品及工作液，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10μl），以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6.  反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。
7.  底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
    建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。
    如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
 
【洗板方法】：
1. 手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將*的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。
2. 自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
 
【特別說明】：
*: [96T/48T]（打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全完整）
#: 一周內(nèi)使用可存于4℃，需長時間存放或多次使用建議存于-20℃，有效期6個月.
 
【試劑盒特點體現(xiàn)】：
1、高效、靈敏、特異的抗體；
2、穩(wěn)定的重復性和可靠性；
3、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相載體；
4、適用血清、血漿、組織勻漿液、細胞培養(yǎng)上清液、尿液等等多種標本類型；
5、節(jié)省實驗經(jīng)費。
elisa試劑盒回收率是反應待測物在樣品分析過程中的損失的程度，損失越少，回收率越高，如果作標液1PPM，就是1毫克/升，而作出標準數(shù)據(jù)為0.99毫克/升，就是說你的回收率是99%，這個與真實成分有密切的關(guān)系，說明方法的準確度。比如水中總無機氯含量測定，樣品水中含有無機氯20mg/L，取100mL被測水樣品，加入0.1mL濃度為10mg/mL的含無機氯標準樣品，測定時忽略體積變化，如果測定出樣品中無機氯為2.98mg/L，則認為回收率為99%。
 
【試劑盒適用范圍】：
1．適用血清、血漿、組織勻漿液、細胞培養(yǎng)上清液、尿液等等多種標本類型；
2．可檢測動物類型豐富：人、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、豬、犬、牛、綿羊、雞、蝦、魚等
3．可檢測指標齊全：白介素，干擾素，血管緊張素，肺炎衣原體，趨化因子、生長因子基質(zhì)金屬蛋白酶、炎癥因子、血管生成素 等等 指標