RNA酶保護試驗((RNase Protection Assay,RPA)是通過液相雜交的方式，用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測RNA表達的技術。與Northern雜交和RT-PCR比較，RPA有以下幾個優點：

1. 檢測靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進行電泳，故損失小，提高了靈敏度。

2. 由于pcr擴增過程中效率不均一和反應“平臺”問題，基于PCR產物量進行分析所得數據的可靠性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數據真實性較高。

3. 由于與反義rna探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進行分析。

4. 步驟較少，耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉膜和洗膜的過程。

5. RNA-RNA雜交體穩定性高，無探針自身復性問題，無須封閉。

6. 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。

7. 檢測分子長度可以任意設置，靈活性大。

RPA的缺點是需要同位素標記探針。

一、試劑準備

1. GACU POOL：取100mM atp、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。

2. 雜交緩沖液：PIPES 0.134g、0.5M EDTA(pH8.0)20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。

3. RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA(pH8.0)20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml

二、操作步驟

1.反義RNA可由含T7或SP6啟動子的重組質粒為模板制備，也可以用含啟動子的PCR產物為模板制備，本文介紹后者。

① 設計含T7啟動子的PCR引物

由于PCR產物將作為合成反義RNA的模板，所以一對引物中的下游引物5’-端要含T7啟動子序列：

T7啟動子序列為：5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引物設計的其他要求與一般PCR引物的設計相同。PCR產物的長度決定了反義RNA探針的長度，具體設計時可考慮100-400bp長。采用巢式PCR，即先擴增出一較長的片段，再以該片段為模板擴增出較短的片段，以保證探針的特異性。

② PCR

先用上游引物和下游引物Ⅰ進行PCR，再以PCR 產物為模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7進行二次PCR(具體操作參見PCR章節)。

③ 探針合成標記與純化

在0.5ml 離心管中加入下列試劑：

RNasin (40U/μl) 0.5μl

GACU POOL GAC(含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM) 2μl

[α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μlDTT (二硫蘇糖醇，0.1M) 1μl

5×轉錄 buffer 2μl

模板(50ng/μl) 1μl

T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl

混合后，短暫離心，37℃保溫1hr。

加入DNaseⅠ(10U/μl)1μl，37℃ 15min，然后75℃10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

加入：飽和酚 50μl

氯防 50μl

酵母tRNA(2μg/μl) 4μl

DEPC H2O 100μl

室溫下充分混勻，離心10000g×2min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100μl氯防，混勻，離心10000g×2min。將上層液轉移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10μl、預冷無水乙醇250μl，混勻后，-20℃靜置30min。4℃離心13500g×10min。棄上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗滌，4℃離心13500g×2min，棄上清液。室溫下揮發殘留乙醇。加入50μl雜交緩沖液溶解沉淀，4℃下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測探針質量。(參見本節電泳步驟)。

2.雜交

① RNA提取后溶解在雜交緩沖液中，濃度為1μg/μl。

② 取8μl RNA加入1-3μl探針(根據探針檢測結果調整)于0.5ml 離心管中。

③ 80℃保溫2min，然后40-45℃下雜交12-18hr。

3. 消化

① 雜交管于37 ℃保溫15min，加入RNase消化液，37℃保溫30min。

② 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混勻，37℃保溫10min。

③ 加入65μl飽和酚和65μl氯防，混勻，室溫離心，10000g×2min。

④ 轉移上層液到另一0.5離心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl異丙醇，混勻后，置-20℃ 30min，4℃離心,135000g×10min。

⑤ 棄上清液，室溫下揮發乙醇，加入5-8μl上樣緩沖液溶解沉淀。

4、電泳與放射自顯影

① 配制凝膠：(50ml)

40%丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺(19：1) 6.25ml

5×TBE 10ml

尿素 24g

加H2O至50ml，溶解后加入25%過硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。

② 預電泳

以1×TBE為上下槽電泳緩沖液，加上電壓后進行預電泳，如果用測序電泳裝置，電壓應達2000v以上，功率設定為100w，溫度設為50℃。待膠板溫度達50℃時，暫停電泳，準備加樣。

③ 加樣

將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80℃加熱2min，立即加樣到膠孔中，電泳1-2hr。(電泳條件同預電泳)。

④ 電泳結束后，打開膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置于暗盒中，暗室紅光下，壓上一張X片，蓋上暗盒，-70℃曝光1-3天。暴光結束后，將X光片顯影、定影、水洗、晾干。

三、注意事項

1.本實驗大部分為RNA操作，注意RNA酶的污染。

2.RNase消化液消化未雜交的單鏈RNA和探針RNA，當探針與樣品之間有堿基錯配時，錯配位點也將被消化，因此會產生片段較小的雜交片段。因此進行PCR時，采取盡量減少錯配的措施。

3、 同位素對RNA合成有一定影響，有時會產生非全長的探針。因此，標記時間不宜過長。

4、 RNase消化液有時會產生過度消化而無檢測信號，可以將消化液稀釋10-100倍后使用。

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