蛋白純化試劑盒主要是利用蛋白與親和介質(zhì)的親和能力不同達(dá)到蛋白分離純化的目的。蛋白純化試劑常見的蛋白標(biāo)簽有GST標(biāo)簽、HIS 標(biāo)簽等，本文主要介紹了蛋白純化試劑盒的原理、His Tag 蛋白純化方法試劑選擇的方法、GST 標(biāo)簽融合蛋白純化問題分析等。

蛋白抽提試劑盒和蛋白純化試劑盒用途有什么不同?

蛋白抽提試劑盒是從細(xì)菌 、真菌、新鮮動(dòng)植物組織或細(xì)胞蛋白、培養(yǎng)動(dòng)植物組織將全細(xì)胞蛋白、核蛋白、胞漿蛋白、化學(xué)修飾基團(tuán)的天然蛋白(例如磷酸化蛋白)中的一種或兩種以上作為目標(biāo)從樣品中分離收集的一套試劑。用于液體樣品中蛋白濃縮、提取、或脫鹽、脫去垢劑、脫還原劑等目的。

蛋白純化試劑盒用于將連接有Flag標(biāo)簽 GST HIS 標(biāo)簽的重組蛋白、包涵體蛋白、抗體從重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中濃縮分離出來(lái)。主要原理是利用蛋白A或蛋白G與抗體的不變區(qū)有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)或Ni-Sepharose與HIS標(biāo)簽蛋白在不同緩沖液條件下親和能力多得多差異分離目標(biāo)蛋白。將蛋白A與Sepharose共價(jià)交聯(lián)制備的層析介質(zhì)，可以用于純化抗體。抗體與蛋白A或蛋白G在高鹽高pH值條件下結(jié)合，在低鹽低pH值條件下解離。蛋白純化試劑盒廣泛的應(yīng)用于蛋白表達(dá)、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關(guān)領(lǐng)域。

GST常見問題解答集錦純化方法的問題解決

以下解決問題的指南指出了對(duì)于大多數(shù)純化方法的普遍問題,對(duì)于特別的純化方法的問題也有 提及,這種情況下會(huì)指出相應(yīng)的純化方法.

GST標(biāo)簽蛋白被機(jī)械裂解的方法                                                         在裂解過程中,用溫和的機(jī)械/化學(xué)裂解條件.                                               裂解的條件 不結(jié)合柱子或 變性(比如超聲).過分的裂解必須依照經(jīng)驗(yàn)來(lái)決定. 結(jié)合非常弱會(huì)使標(biāo)簽蛋白變性,阻止其結(jié)合. GST標(biāo)簽蛋白在樣品中有聚集,在細(xì)胞裂解前加入DTT,在緩沖液中也加入DTT.1-20mM 導(dǎo)致沉淀 標(biāo)簽蛋白的濃度過低的DTT會(huì)顯著增加某些GST蛋白的結(jié)合. 濃縮樣品.結(jié)合能力是濃度依賴的.低表達(dá)量的蛋白可能 不會(huì)像高表達(dá)量蛋白那樣有效地結(jié)合柱子.因此,濃縮樣 品會(huì)提高結(jié)合. 標(biāo) 簽 蛋 白 可 能 改 變 了 G S T 的 構(gòu) 檢測(cè)所使用的pGEX載體中GST的結(jié)合.準(zhǔn)備帶有所使用的 象,因此降低了GST標(biāo)簽蛋白的 pGEX的細(xì)胞超聲裂解物,檢測(cè)其與柱材的結(jié)合.如果結(jié)合 結(jié)合能力. 的很好,則可能是標(biāo)簽蛋白改變了GST的構(gòu)象,因此降低了 GST標(biāo)簽蛋白的親和力.可以通過降低結(jié)合的溫度到4°C限 制洗滌來(lái)改善結(jié)果. 平衡時(shí)間太短 確認(rèn)柱材至少用5倍柱體積的pH6.5到8.0的緩沖液平衡過 (比如PBS). GST標(biāo)簽蛋白在pH值低于6.5和高 在凈化好的樣品上樣前用pH6.5到8.0的緩沖液平衡過(比如 于8時(shí)結(jié)合效率低 GSTrap柱:柱子需要清洗 PBS). 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的清洗步驟清洗柱子(見附錄2).如果GSTrap柱 已經(jīng)用過幾次了,可能需要換用新柱. Glutathione Sepharose柱材使用 使用新的Glutathione Sepharose柱材(清洗過程請(qǐng)見附錄 次數(shù)過多 樣品上樣過程中的流速過高 2) 降低在上樣時(shí)的流速.影響GST標(biāo)簽蛋白結(jié)合的一個(gè)重要參 數(shù)就是流速.由于GST與谷胱甘肽相對(duì)慢的結(jié)合,在樣品上 樣過程中保持低流速以獲得zui大結(jié)合能力很重要. 在KTAprime plus上的GSTrap 柱子堵住了:根據(jù)說(shuō)明書清潔柱子,確認(rèn)樣品已經(jīng)離心或 柱:柱子或系統(tǒng)被堵住了,導(dǎo)致 用0.45m的濾膜過濾過了. 高壓力和無(wú)結(jié)合. 系統(tǒng)堵住了:將柱子換成一段管子.如果壓力高于 0.3MPa,根據(jù)手冊(cè)清洗系統(tǒng) 在KTAprime plus上的GSTrap 檢測(cè)是否使用了正確的柱子. 柱:樣品不結(jié)合 檢測(cè)流入管是否接入了正確的流入端口. 檢測(cè)緩沖液的組成和pH值是否正確.檢測(cè)樣品是否已經(jīng)被 調(diào)節(jié)到適合結(jié)合緩沖液的條件.

1G S T 標(biāo) 簽 蛋 白 洗脫緩沖液的體積不夠 不能被的 洗脫 洗脫的時(shí)間不夠

增加洗脫緩沖液的體積.有些情況下,尤其是柱上酶切有 標(biāo)簽蛋白時(shí),需要更大體積的緩沖液來(lái)洗脫標(biāo)簽蛋白. 通過降低洗脫過程中的流速來(lái)增加洗脫時(shí)間. 對(duì)于gstrap柱,為了獲得的結(jié)果,在樣品上樣時(shí),用 0.2到1ml/min的流速(1ml HiTrap柱),0.5到5ml/min的流 速(5ml HiTrap柱).對(duì)于離心方法,降低洗脫過程中的離 心速度.

谷胱甘肽的濃度不夠

增加洗脫緩沖液中谷胱甘肽的濃度:本方案中建議的10mM 濃度對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用來(lái)說(shuō)足夠了,但是也存在例外.嘗試 使用50mM Tris-HCl,20-40mM 還原型谷胱甘肽,pH8.0作 為洗脫緩沖液.

洗脫緩沖液的pH過低

增加洗脫緩沖液的pH值:將pH增加到8-9會(huì)增強(qiáng)洗脫而不 用提高洗脫所用谷胱甘肽的濃度.

洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度過低.

增加洗脫緩沖液中的離子強(qiáng)度,在洗脫緩沖液中加入0.10.2M的氯化鈉也會(huì)使結(jié)果變好.

洗脫緩沖也中的谷胱甘肽被氧化 使用新鮮的洗脫緩沖液. 了 加入DTT.

非特異的疏水相互作用導(dǎo)致蛋白 向洗脫緩沖液中加入非離子去垢劑.加入1%的TritonX-100 和柱材非特異的結(jié)合或聚集,從 或2%的n-octylglucoside可以顯著提高某些GST標(biāo)簽蛋白的 而 阻 止 了 標(biāo) 簽 蛋 白 的 溶 解 和 洗 洗脫. 脫. 電泳或蛋白質(zhì) 分子量為70 000 的蛋白與GST標(biāo) 分子量為70 000 的蛋白可能是大腸桿菌dnaK基因的產(chǎn)物. 免疫印跡檢測(cè) 簽蛋白共純化 發(fā)現(xiàn)多條條帶 該蛋白參與大腸桿菌中蛋白質(zhì)折疊.有報(bào)道這種相互作 用可以通過上樣前在50mM Tris-HCl,2mM ATP,10mM MgSO4,pH7.4中37°C溫浴10分鐘而破壞.或者把有標(biāo)簽 蛋白通過ATP-agarose或相似的純化介質(zhì)或進(jìn)行離子交換層 析來(lái)除去. 標(biāo)簽蛋白被蛋白酶部分降解 加入蛋白酶抑制劑.多條條帶可能是由于目的蛋白被蛋白 酶部分降解的結(jié)果.在裂解溶液中加入1mM PMSF可能會(huì) 使結(jié)果變好.一種無(wú)毒的水溶性的PMSF替代物是AEBSF, Roche Biochemicals的商品名為Pefabloc SC.注:絲氨酸 蛋白酶抑制劑必須在使用凝血酶或凝血因子Xa前除去. Prescission Protease不是一種經(jīng)典的絲氨酸蛋白酶.經(jīng)GE Healthcare檢測(cè),它對(duì)很多蛋白酶抑制劑不敏感. PMSF有毒,有急性作用.如果可能的話使用Pefabloc SC.

2在宿主細(xì)菌中的蛋白降解

用一種蛋白酶缺失型宿主:多條帶可能是在宿主細(xì)菌中蛋 白酶切造成的.如果是這種情況,或許需要蛋白酶缺陷型 菌株(比如lon-或ompT).大腸桿菌BL21隨pGEX載體提供. 這種菌株是ompT和lon缺陷型菌株.

在機(jī)械裂解過程中細(xì)胞破碎

降低裂解時(shí)間:細(xì)胞裂解表面上是使懸濁液部分澄清,可 以通過鏡檢檢測(cè).機(jī)械裂解前加入溶菌酶(0.1倍體積的10 毫克/毫升溶菌酶溶液,溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0 )可能會(huì)使結(jié)果變好.避免發(fā)泡,因?yàn)檫@可能使標(biāo)簽蛋白 變性.過分裂解也會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞蛋白和GST標(biāo)簽蛋白共純 化.

分子伴侶可能被共純化了

包括額外的純化步驟:多余的條帶可能由于共純化一些分 子伴侶所造成.這些分子伴侶參與大腸桿菌中新生成的蛋 白的正確折疊.這些包括,但不僅僅是:DnaK(分子量70 000)DnaJ(分子量37 000)GrpE(分子量40 000)GroEL (分子量57 000)GroES(分子量10 000).一些從這些共 純化的蛋白中分離GST標(biāo)簽蛋白的方法已經(jīng)發(fā)表.

抗體和很多種大腸桿菌中的蛋白 抗體和大腸桿菌蛋白交叉反應(yīng):取決于抗GST抗體的來(lái)源. 反應(yīng) 它可能包含一些抗體,這些抗體與標(biāo)簽蛋白樣品中的大腸 桿菌蛋白能夠反應(yīng).通過和大腸桿菌的超聲裂解物反應(yīng)來(lái) 除掉那些能夠交叉反應(yīng)的抗體.GE Healthcare的GST抗體已 經(jīng)和大腸桿菌蛋白進(jìn)行過交叉吸附,并檢測(cè)證明其在蛋白 質(zhì)免疫印跡中沒有非特異條帶. 目的蛋白酶切 蛋白酶切發(fā)生在宿主細(xì)菌內(nèi) 后電泳檢測(cè)發(fā) 現(xiàn)多條條帶 檢測(cè)條帶何時(shí)出現(xiàn):確定多余的條帶在Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa切割前不存在.這些條帶可 能是在宿主細(xì)菌中降解的結(jié)果. 目的蛋白可能含有Precission Protease,凝血酶,凝血因子 Xa的切割位點(diǎn),檢查序列.細(xì)節(jié)請(qǐng)參見《GST基因融合系統(tǒng) 手冊(cè)》.

His Tag 蛋白純化方法之選擇全攻略

HisTag 蛋白純化篇：用基因工程的方法來(lái)表達(dá)蛋白質(zhì)，必須經(jīng)過純化才 能實(shí)現(xiàn)zui終目的。相比核酸純化來(lái)說(shuō)，不同的蛋白質(zhì)特性千差萬(wàn)別，純化條件很難摸索，想 找一種通用的純化方法一直是個(gè)難題。 將目的蛋白和一個(gè)親和純化短標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)， 通 過親和純化 Tag 蛋白來(lái)純化目的蛋白，是我們常用的間接手段。 用于融合表達(dá)的親和純化蛋白標(biāo)簽，首先個(gè)子越小越好，這樣不會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白的構(gòu)象、大小 和特性產(chǎn)生顯著影響，方便直接對(duì)融合蛋白進(jìn)行下游操作;以前常用的融合表達(dá)親和標(biāo)簽 GST(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)個(gè)子就比較大，在純化后需要先切除標(biāo)簽后才能進(jìn)行下一步的檢測(cè)分 析。其二生理?xiàng)l件下帶電越少越好：需要借助融合表達(dá)純化的許多蛋白通常在生理溶液 pH 下進(jìn)行分析研究或者復(fù)性，融合標(biāo)簽帶電少，對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)、分泌、折疊、構(gòu)象形成等影 響小，比較容易得到和天然蛋白相似的產(chǎn)物。第三融合標(biāo)簽的免疫原性越少越好，融合產(chǎn)物 不必除去標(biāo)簽可直接作為抗原免疫 橫看豎看，6xHis Tag 都是比較理想的，6 個(gè)組氨酸個(gè)子小，pH8 是不帶電，免疫原性差， 利用的帶鎳離子的純化填料進(jìn)行親和純化，目標(biāo)蛋白純度高，方法簡(jiǎn)單方便，成本低， 已得到國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛應(yīng)用。想當(dāng)年剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時(shí),表達(dá) 6xHis 的 HisTag 還算“前 衛(wèi)”技術(shù)(表達(dá)純化一個(gè)帶有 HisTag 的“有重要意義和光輝前景的”蛋白就可以混個(gè)碩士 畢業(yè))，如今早成主流了。 我們生物通技術(shù)專題早前的表達(dá)系統(tǒng)專題中已經(jīng)介紹過多種帶有 His-Tag 的表達(dá)載體， 表達(dá) 之后自然需要考慮如何純化，市面上純化 HisTag 的產(chǎn)品多種多樣，應(yīng)該如何選擇呢?目前 市面上主產(chǎn)品都是利用 His.Tag 序列相鄰組氨酸和固定化金屬鎳離子的親和力來(lái)進(jìn)行純 化。 金屬鎳離子被螯合到固相支持物共價(jià)結(jié)合的反應(yīng)性基團(tuán)上， 當(dāng)融合蛋白溶液流經(jīng)親和純 化介質(zhì)時(shí)，融合蛋白被特異親和吸附，雜質(zhì)被洗掉后再洗脫目標(biāo)蛋白。zui常用的螯合物包括 氮川乙酸(NTA)和亞氨二乙酸(IDA)，它們分別具有四個(gè)和三個(gè)與金屬離子相互作用的位 點(diǎn)。生物通在這里介紹幾個(gè)市面口碑較好的產(chǎn)品和方法,包括常見的 HisTag 純化品牌： Qiagen，GE，Novagen 等。 Qiagen 產(chǎn)品的 2 大特點(diǎn)是 4 價(jià)螯合的 Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid);以及種 類齊全。Qiagen 的 4 價(jià)螯合的 Ni-NTA 純化填料，由于鎳離子通過 4 價(jià)鍵螯合在純化樹 脂(填料)上，比 3 價(jià)的 Ni-IDA 要穩(wěn)固且不容易脫落，且 NTA 與還原二硫鍵的 beta- 巰基乙 醇相容;而存在其它螯合或還原成分時(shí)， IDA 樹脂的金屬鎳離子容易脫落可導(dǎo)致純化結(jié)果 不甚理想。因此 Ni-NTA 實(shí)際應(yīng)用中的蛋白純化效率和得率較高。因于這種穩(wěn)固性，Qiagen 的 Ni-NTA 純化介質(zhì)不單可用于純化帶 HisTag 的表達(dá)產(chǎn)物， 還可以作為固定介質(zhì)用于研究蛋 白質(zhì)間的相互作用或者蛋白質(zhì)和核酸間的相互作用、 研究蛋白質(zhì)受體和配基的相互作用、 甚至用于純化與融合蛋白相互作用的其他蛋白或者核酸。

Qiagen 的 Ni-NTA 純化介質(zhì)產(chǎn)品種類zui為齊全，設(shè)計(jì)非常細(xì)心體貼，不過花太多，就容易眼 花繚亂，我們說(shuō)花多眼亂。Qiagen 的目錄里是根據(jù)純化實(shí)驗(yàn)的規(guī)模分為大、中、小規(guī)模， 具體又分為高通量和手工純化等區(qū)別， 對(duì)于急著尋找自己需要產(chǎn)品的人來(lái)說(shuō)自然便捷; 不過 作為生物通的技術(shù)專題文章， 我個(gè)人來(lái)說(shuō)更愿意按照介質(zhì)種類的不同來(lái)介紹， 因?yàn)槔斫饬瞬?料的區(qū)別，一切都清晰明了，就能更深入了解不同品牌、不同類型、不同產(chǎn)品的特色。 Qiagen 的 Ni-NTA 系列產(chǎn)品可分為 4 類：Ni-NTA 瓊脂糖、Ni-NTA Superflow、Ni-NTA 磁珠、 Ni-NTA 離心柱(Spin Column)。 昔年做銷售時(shí) Ni-NTA 瓊脂糖是zui多人買，因?yàn)閮r(jià)格相對(duì)便宜，質(zhì)需要將澄清的裂解液(或 者離心或者過濾)直接上柱，洗脫，就可以一步純化出帶有 His Tag 的融合蛋白。這個(gè)目標(biāo) 蛋白載量 10mg/ml 左右，介質(zhì)是 Sepharose CL-6B，zui大流速是每分鐘 1 毫升，可耐受的zui 大柱內(nèi)壓 2.8psi(0.2bar)，適合自己裝重力流常壓液相層析柱，可以根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)蛋 白的含量來(lái)調(diào)整純化填料的使用量和裝柱的長(zhǎng)度，比較靈活避免浪費(fèi)。不過但凡客戶問到， 我都愿意推薦 Ni-NTA Superflow。Ni-NTA Superflow 介質(zhì)是高度交聯(lián)的瓊脂糖凝膠，同樣 只需一步就從澄清的細(xì)菌裂解物中純化得到帶有 HisTag 的融合蛋白，可以耐受天然或者變 性條件，包括 8M 尿素，或者 6M 鹽酸胍，還可以耐受 20mM 的巰基乙醇或者 10mM 的 DTT 等還 原劑。除此之外，Ni-NTA Superflow 可以耐受更高的壓力(140psi,10bar),流速更快(zui 大可達(dá)到 20ml/min)，可以上快速蛋白液相色譜(FPLC)，載量達(dá)到 20mg/ml。我們都知道 做蛋白純化是非常考耐性的工作， 如果是自己裝稍微長(zhǎng)些的重力流柱， 整個(gè)純化過程無(wú)比漫 長(zhǎng)。流出的速度過快不單影響結(jié)果，還會(huì)損害純化柱子。選擇速度、耐性和強(qiáng)度都更加出色 的 Ni-NTA Superflow 自然更好些。兩種填料都可以耐受很寬的 pH 范圍(pH3-12)，如果處 理時(shí)間在 2 小時(shí)內(nèi)，都可以耐受 pH2-14 而保持穩(wěn)定。 純化填料雖然在使用上比較靈活節(jié)約， 可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)蛋白的大概含量來(lái)調(diào)整裝柱的填 料多少，不過裝柱始終是個(gè)麻煩事，速度慢不說(shuō)，有氣泡、有裂縫、干柱等等意外就會(huì)前功 盡棄， 每次裝柱的差異都有可能影響結(jié)果的重復(fù)性。 散裝填料更適合那些專門做純化或者蛋 白純化經(jīng)驗(yàn)非常豐富的高手。Qiagen 很快意識(shí)到，對(duì)于多數(shù)實(shí)驗(yàn)人員來(lái)說(shuō)，更重要的是利 用*的實(shí)驗(yàn)工具或者方法快速得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而不是反復(fù)練習(xí)實(shí)驗(yàn)技能。于是，Ni-NTA Superflow 預(yù)裝柱上市了。這種預(yù)裝 1ml 或者 5ml 的柱子保留了填料的大部分優(yōu)點(diǎn)，省掉了 自裝柱子的麻煩， zui重要的是令實(shí)驗(yàn)?zāi)艿玫礁玫闹貜?fù)性。 預(yù)裝柱既可以適配于多種型號(hào)的 快速蛋白液相色譜儀或者蛋白純化工作站， 也可以利用注射器進(jìn)行手工操作。 優(yōu)化的 Ni-NTA Superflow 預(yù)裝柱的再生非常方便， 僅需要用 NaOH 流過處理 30 分鐘即可再生使用。 離子 Ni 結(jié)合相當(dāng)牢固，就算多次再生后，偶然發(fā)現(xiàn)純化效果下降需要用鎳離子重新螯合填料，其操 作也相當(dāng)簡(jiǎn)便。 除了 Ni-NTA 瓊脂糖、 Ni-NTA Superflow， 另外一個(gè)好用的是 Ni-NTA 離心柱 (Spin Column) 。 這個(gè) Ni-NTA 離心柱(Spin Column)和核酸純化的小離心柱很象，不用慢慢等它一滴一滴 流， 也不要特殊的豪華儀器， 只要離心機(jī)就夠了， 真的非常方便。 每個(gè)柱子載量是 150 微克，

特別適合研究的初期階段時(shí)小量純化做快速的檢測(cè)分析。 畢竟， 要做到摸條件大規(guī)模純化蛋 白的，還遠(yuǎn)著呢，花那工夫不如早點(diǎn)出結(jié)果哦。 至于 Ni-NTA 磁珠，那是為高通量快速純化多個(gè)微量樣品的機(jī)器而準(zhǔn)備的，因?yàn)榧兓^程中 需要吸附、洗滌、洗脫等多個(gè)步驟，利用磁珠在磁場(chǎng)中的懸浮就可以很方便的進(jìn)行這些步驟 而避免抽濾，減少抽濾對(duì)蛋白產(chǎn)物的影響。Ni-NTA 磁珠配合 Qiagen 的純化工作站，對(duì) 于是手工操作就沒有多少意義。

蛋白純化試劑盒需要有目標(biāo)蛋白有親和純化標(biāo)簽，例如：HIS（組氨酸標(biāo)記）、GST(glutathione Stransferase )，利用親和純化介質(zhì)與蛋白間的相互作用，達(dá)到了分離純化蛋白的目的。生物幫蛋白純化試劑盒產(chǎn)品推薦：GST標(biāo)簽純化試劑盒（高通量）、組氨酸標(biāo)記純化試劑盒（高通量）、組氨酸標(biāo)記純化試劑盒、磷酸肽純化試劑盒、鏈霉素標(biāo)簽親和純化試劑盒、T7 標(biāo)簽純化試劑盒、自動(dòng)蛋白質(zhì)純化試劑盒（磁珠）、免疫球蛋白G純化試劑盒（蛋白A）、免疫球蛋白G純化試劑盒（蛋白G）、其他抗體純化試劑盒。