Elispot的歷史可以追溯到1963年Jerne等人創(chuàng)立的溶血空斑技術(shù)(hemo-lytic plaque forming cell assay ，HPF)，這項技術(shù)可用于檢測并計數(shù)單個抗體形成細(xì)胞。隨著單克隆抗體技術(shù)的成熟，1983年，Czerkinsky等采用此法檢測脾細(xì)胞中分泌特異性抗體的細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)該方法敏感性高簡便易行。后來，他們又用這種方法定量分析受到有絲分裂原刺激的外周血中分泌IFN2γ的細(xì)胞數(shù)。隨后，用ELISPOT法在單細(xì)胞水平檢測分泌其他細(xì)胞因子(如IL-2 ， IL-4 ， IL-5 ， IL-10 ， TNFα和IL-6) 數(shù)量的手段也被建立起來。Nordstrom 等用生物素-抗生物素蛋白生物放大來提高這種方法的敏感性，Herr用計算機輔助圖像分析系統(tǒng)(computer-assisted video image analysis ，CVIA) 自動分析TNF2α酶聯(lián)免疫斑點的大小和數(shù)量，計算與負(fù)載抗原肽的靶細(xì)胞接觸后外周血單核細(xì)胞(PBMC) 中抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，不但提高了對背景染色的分辨力也使大規(guī)模研究成為可能。Vaquerano等將數(shù)碼相機和計算機結(jié)合起來，開發(fā)出類似的斑點計數(shù)系統(tǒng)，認(rèn)為當(dāng)每孔斑點數(shù)大于100時，這種方法更客觀、可重復(fù)性高且節(jié)省時間。

隨著ELISPOT技術(shù)的不斷發(fā)展，它的優(yōu)勢也漸漸顯示出來，下面將列舉ELISPOT對比其它一些傳統(tǒng)技術(shù)的優(yōu)勢所在。

一、elisa

ELISA 通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。ELISPOT 也是通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過計算機輔助的分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)， 1個斑點代表1個細(xì)胞，從而計算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。(某些研究不僅要測細(xì)胞因子生成量，還需檢測分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率) 由于是單細(xì)胞水平檢測，ELISPOT比ELISA更靈敏，能從20萬-30萬細(xì)胞中檢出1個分泌該蛋白的細(xì)胞。捕獲抗體具有高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素的單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時，不會影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。

二、有限稀釋法(limiting dilution analysis ，LDA)

LDA能夠?qū)μ禺愋訡TL細(xì)胞進行定量，曾在很多年中被認(rèn)為是CTL 檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，它使人們能夠詳細(xì)了解免疫反應(yīng)動力學(xué)和記憶毒性T淋巴細(xì)胞(memorial CTL， mCTL) 亞群的細(xì)胞周期。但該方法需要高強度抗原刺激， 這會加快效應(yīng)CTL(eCTL)凋亡，且不能定量測定eCTL細(xì)胞數(shù)量或測定值偏低。其次，該方法較繁瑣，培養(yǎng)時間可長達2～3周，而且很容易造成T細(xì)胞數(shù)量損失。

三、四聚體法(Tetramer)

zui近幾年出現(xiàn)了MHC2Ⅰ類分子抗原肽四聚體法。該法的優(yōu)勢在于迅速、直接、靈敏且特異性強，即使當(dāng)體內(nèi)mCTL水平低于1%，用MHC2Ⅰ抗原肽四聚體法仍可直接測到準(zhǔn)確的值，比LDA 敏感度要高5～10倍。但該技術(shù)也存在較多應(yīng)用上的困難：除了合成及穩(wěn)定MHCⅠ類分子的技術(shù)困難外，zui主要缺點是表位的選擇。由于每次反應(yīng)只能分析單一的抗原表位，而MHCⅠ類分子結(jié)合的各種表位，能否形成CTL反應(yīng)，卻隨著基因背景及時間的變化而變化，因此選擇正確的表位就顯得尤為重要。優(yōu)勢表位的篩選可以通過Elispot 來進行，但對整個肽庫進行掃描，并不是一件很容易的事。當(dāng)然，生物信息學(xué)的運用對表位的篩選有很大的幫助。同時，有研究結(jié)果表明，并非所有經(jīng)過Tetramer 鑒定的陽性細(xì)胞都有確切的功能， Tetramer陽性的細(xì)胞數(shù)是用ELISPOT分析能分泌INF2γ細(xì)胞數(shù)的10倍，其中很多是不表現(xiàn)功能的惰性細(xì)胞，可能代表了記憶型CTL前體細(xì)胞。Tetramer分析只增加了分析的靈敏度，同時測定其功能很重要。

四、Cr51釋放法

此法是一種比較經(jīng)典的方法，雖然在檢測CTL識別的抗原多樣性方面非常有效，且能闡明被CTL識別的表位，但至多為半定量的層面，而且Cr51標(biāo)記細(xì)胞的自發(fā)釋放率較高，不適于較長時間培養(yǎng);標(biāo)記時所需的細(xì)胞濃度較高，因而給試驗帶來諸多不便;此外，Cr51釋放法所測定的是一個細(xì)胞群體的特性，而不是單個細(xì)胞。

五、胞內(nèi)CK染色法

與ELISPOT法相比較，胞內(nèi)CK染色法(intra-cellular CK staining，ICS) 主要應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)累積細(xì)胞因子的染色和多色參數(shù)的FACS法，是檢測循環(huán)淋巴細(xì)胞中抗原特異性T 淋巴細(xì)胞的可行方法，而ELISPOT法卻可以檢測所有分泌CK的eCTL。

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