冰凍切片的免疫組化染色操作步驟：

1. 新鮮組織立即在恒冷冰凍切片機內切片( 也可- 80℃保存)，厚度為 5～6μm。

2. 載玻片可不打底，裱片后，立即用電吹風吹干。

3. 如不馬上染色，可密封后- 20℃保存。

4. 染色前用冷丙酮在 4℃固定 10-20 分鐘。

5. PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘，( 必要時應用 0.1%檸檬酸鈉+0.1%triton打孔)

6. 3% H2O2滅活內源性過氧化物酶，20 分鐘，避光;

7. 用 PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘;

8. 正常血清封閉：從染片缸中取出切片，擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分 (保持組織呈濕潤狀態,)滴加正常山羊或兔血清 (與第二抗 體 同源動物血清)處理，37℃，15 分鐘。

附：正常血清配制 ( 或按試劑盒規定的濃度配制)：按 1:20比例，用 PBS 配制，每張切片需要量按 50μ+5μl (10%拋灑量) 計算。

9.滴加*抗體：用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加*抗體，37℃ 2 小時(也可置于 4℃冰箱過夜) 。

10.PBS：5 分鐘，2 次(置于搖床) 。

11.滴加生物素化的二抗，37℃，40 分鐘。

12.PBS：5 分鐘，2 次(置于搖床) 。

13.滴加三抗 (SAB 復合物) ，37℃，40 分鐘。

14.PBS：5 分鐘，2 次(置于搖床) 。

15.DAB 顯色，鏡下觀察，適時終止(自來水沖終止) 。

附：DAB 的配制① 儲備液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待*溶解后分裝成 1ml，100μl，50μl ，20μl 等，-20℃，凍存。② 工作液：DAB 儲備液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl

16.自來水(細水)充分沖洗。

17.蘇木素復染，室溫，30 秒，自來水沖洗。

18.自來水沖洗返藍，15 分鐘。

19.梯度酒精脫水：80%，2 分鐘 95%，2 分鐘 100%，2 次，5 分鐘。

20.二甲苯透明：I ，II (二甲苯)各 5 分鐘

21.封片：加拿大樹膠(或中性樹膠)封片。

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