試想一下，若沒有各種方法來分離組成細胞的不同區室和組分，那么現代生物學將困難重重。從細胞信號通路到新陳代謝，人們一直想知道，它們在哪兒，過去、現在及將來。

市場部Monica O’Hara Noonan介紹，研究人員對細胞進行分級分離(fractionate)的原因有很多。他們可能希望，當感興趣的蛋白在某些條件下或某種處理之后轉位時，對其進行追蹤。對細胞進行分級分離能增強低豐度蛋白的檢測能力，或降低下游分析或功能分析的復雜性。

如果您正在從事這一方面的研究，請繼續往下讀。從細胞上講，我們會幫助您將小麥和谷殼分開。

細胞的組分

如何對細胞進行分級分離取決于很多因素，包括哪些儀器、知識可以利用，您想要分離什么，以及這些組分的下游應用是什么。

離心是細胞分級分離中zui常用的技術之一，它們單獨使用，或與其他方法結合。例如，對于高爾基體或過氧化物酶體，大部分操作都要求高速的密度梯度離心。然而，O’Hara Noonan也指出，超速離心也有一些缺點，包括超速離心機是高價的儀器，有些實驗室無法接觸到。另外，密度梯度難以傾倒是出了名的，其結果是技術依賴的。

當然，其他的許多組分也可以只利用試劑和臺式儀器來富集。供應商開發出一些試劑盒，能方便快捷地帶來高度富集的細胞組分。Mem-PER Plus試劑盒，能在一小時之內富集完整的膜相關蛋白。

據sigma-aldrich的產品專家Michael Moehlenbrock介紹，這類試劑盒的原理在很大程度上是類似的。它們往往使用低滲緩沖液給細胞膜帶來壓力，然后用等滲的提取緩沖液(帶或不帶還原劑和蛋白酶抑制劑)來維持感興趣的細胞器。有時也需要機械裂解或去污劑裂解。“各個不同供應商在細胞分級分離試劑盒的設計上都是一致的，而不同細胞組分的差異在于緩沖液組成、裂解試劑和離心速度，”Moehlenbrock說。

此類試劑盒的價值并不在于某些秘密試劑，而在于QC系統的一致性和重復性。“細胞分級分離的方法已經過充分鑒定，其操作步驟適用于大部分應用，”Moehlenbrock說。“商業化試劑盒為zui終用戶帶來了簡便和效率，同時提供了*的安全性。”

通過改變穿插在離心步驟之間的緩沖液的去污劑組分，研究人員可分離不止一個組分。例如，市場上許多試劑盒可收集細胞核和胞漿蛋白。其他試劑盒也帶來了三個或四個不同的組分。Cell Signaling Technology的Cell Fractionation Kit產生了細胞質、細胞膜/細胞器以及細胞核/細胞骨架組分，而QIAGEN的Qproteome Cell Compartment Kit分離出細胞質、細胞膜、細胞核和細胞骨架組分。

美天旎提供一種不含去污劑的試劑盒，它利用TOM22抗體標記的磁珠來特異分離線粒體。據該公司的介紹，他們不提供其他亞細胞組分的產品，但客戶可以利用自己的抗體來間接分離其他組分。

同樣地，賽默飛的Cell Surface Protein Isolation Kit標記細胞表面蛋白的外部賴氨酸，它具有一個可切割的生物素衍生物，讓此蛋白組分在細胞裂解后可被捕獲。

其中有什么

在細胞組分被分離出來之后，必須驗證您的實驗，并確認這些組分確實包含了您要分離的。盡管這些試劑盒通常不包含區分各種組分的試劑，但許多會指出不同的看家基因，讓您用來確保質量。Moehlenbrock表示：“在某些情況下，我們會提供分析的建議。”例如，Sigma-Aldrich Mitochondria Isolation Kit的技術指南建議檢查細胞色素c氧化酶活性和檸檬酸合酶活性，以確認外膜和內膜的完整性。

Cell Signaling Technology也提供Cell Fractionation Antibody Sampler Kit，作為分級分離試劑盒的伴隨產品。生產科學家Jim Cormier介紹，當您在運行Western時，您會得到一個量化值，哪些組分占多少。Sampler Kit包含細胞質MEK1/2、線粒體凋亡誘導因子(AIF)、組蛋白H3和細胞骨架波形蛋白的兔單克隆抗體，以及山羊抗兔IgG。

研究人員也可利用試劑盒中的建議，或搜索文獻，組裝自己的Western blot或ELISA試劑盒。不過Cormier也提醒，并非每個抗體都有著它應有的特異性。

下游的分析

與超速離心相比，基于試劑盒的細胞分級分離方法快速又方便，也適合多個下游應用，如EMSA、報告基因分析、酶活分析和Western blot。

然而，制備過程中所使用的去污劑和鹽可能阻礙蛋白質組學的應用，如質譜，“這有時取決于去污劑的量，去除的容易程度，以及是否用于功能分析，”O’Hara Noonan說。“在某些情況下，您可能需要透析或脫鹽。”

同樣地，有時可能需要額外的步驟，來增加產物的純度。在讀研究生時，Moehlenbrock一般使用臺式離心機來制備線粒體。“有時我會用11,000 x g來去除細胞碎片。之后獲得線粒體提取物，并用蔗糖梯度和超速離心機來進一步純化。這取決于您想做什么，”他回憶道。

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