一、 概述
可溶性抗原（如細菌浸出液、含菌病料浸出液、血清以及其他來源的蛋白質(zhì)、多糖質(zhì)、類脂體等）與其相應(yīng)的抗體相遇后，在電解質(zhì)參與下，抗原抗體結(jié)合形成白色絮狀沉淀，出現(xiàn)白色沉淀線，此種現(xiàn)象稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)中的抗原叫沉淀原（precipitinogen）,與沉淀原發(fā)生反應(yīng)的抗體稱為沉淀素（precipitin）。沉淀反應(yīng)的發(fā)生機制與凝集反應(yīng)基本相同。不同之點是：沉淀原分子小，單位體積內(nèi)總面積大，故在定量試驗時，通常稀釋抗原。沉淀反應(yīng)主要包括有環(huán)狀沉淀反應(yīng)、絮狀沉淀反應(yīng)和瓊脂擴散反應(yīng)。環(huán)狀沉淀反應(yīng)是zui早的沉淀反應(yīng)，目前在鏈球菌的分類、鑒定，昆蟲吸血性能及所吸血液來自何種動物的鑒別，肉品種屬鑒定及炭疽尸體與皮張的檢驗工作中仍然應(yīng)用。主要是用已知的抗體診斷未知的抗原。絮狀沉淀反應(yīng)是將抗原與血清在試管內(nèi)混合，在電解質(zhì)存在的情況下，抗原抗體復(fù)合物可形成混濁沉淀或絮狀沉淀凝聚物，此法通常用于毒素與抗毒素的滴定。瓊脂凝膠免疫擴散（Agar－gel immunodiffusion）是沉淀反應(yīng)的一種形式，是指抗原抗體在瓊脂凝膠內(nèi)擴散，特異性的抗原抗體相遇后，在凝膠內(nèi)的電解質(zhì)參與下發(fā)生沉淀，形成可見的沉淀線。這種反應(yīng)簡稱瓊脂擴散。
抗原抗體擴散使用的凝膠種類很多，除瓊脂外還有明膠、果膠、聚丙烯酰胺等，因此總的名稱叫免疫擴散（Immunodiffusion 簡寫為ID）。瓊脂擴散是免疫擴散中的一種方法。
瓊脂擴散的原理是：物質(zhì)自由運動形成擴散現(xiàn)象，擴散可以在各種介質(zhì)中進行。我們所使用的1％～2%的瓊脂凝膠，瓊脂形成網(wǎng)狀構(gòu)架，空隙中是 98％~99%的水，擴散就在此水中進行。1％~2%瓊脂所形成的構(gòu)架網(wǎng)孔較大，允許分子量在20萬以下甚至更大些的大分子物質(zhì)通過，絕大多數(shù)可溶性抗原和抗體的分子量在20萬以下，因此可以在瓊脂凝膠中自由擴散，所受阻力甚小。二者在瓊脂凝膠中相遇，在zui適比例處發(fā)生沉淀，此沉淀物因顆粒較大而不擴散，故形成沉淀帶。
一種抗原抗體系統(tǒng)只出現(xiàn)一條沉淀帶，復(fù)合物抗原中的多種抗原抗體系統(tǒng)均可根據(jù)自己的濃度、擴散系數(shù)、zui適比等因素形成自己的沉淀帶。本法的主要優(yōu)點是能將復(fù)合的抗原成分加以區(qū)分，根據(jù)沉淀帶出現(xiàn)的數(shù)目、位置以及相鄰二條沉淀帶之間的融合、交叉、分枝等情況，就可了解該復(fù)合抗原的組成。
二、環(huán)狀沉淀反應(yīng)
以炭疽環(huán)狀沉淀反應(yīng)為例，此反應(yīng)又稱Ascoli氏反應(yīng)。
（一）材料與試劑
1．已知炭疽沉淀血清，購買自生物制品所。
2．待測炭疽沉淀抗原
3．試管5mm×50mm、滴管
4．0.3%石炭酸生里鹽水
（二）操作方法
1．待測抗原的提取
（1）取可疑為炭疽而死的病畜的實質(zhì)臟器1g，放入試管或小三角燒瓶中，加生里鹽水5ml～10ml，煮沸30min～40min，冷卻后用濾紙過濾得清澈的液體，即為待測抗原。
（2）如病料是皮張，可采用冷浸法。將樣品高壓滅活后，剪成小塊并稱重，加約5倍的0.5%生里鹽水，室溫浸泡18h～24小時，濾紙過濾，即為待檢抗原。
2．取試管5支（5mm×50mm）置于試管架上，編號。第1、2試管內(nèi)加炭疽沉淀血清，第3、4試管內(nèi)加正常血清，第5管內(nèi)加待檢抗原，分別用毛細滴管加至4mm～5mm。
3．第1、4、5試管輕輕疊加等量緩沖液，第2、3試管輕輕疊加等量待檢抗原。為防止上下兩界面破壞，可將小試管從試管架取出，微傾斜，沿試管壁加入緩沖液或抗原。
4．在試管架上靜置數(shù)分鐘，觀察結(jié)果。
（三）結(jié)果判定
第2管內(nèi)兩液界面出現(xiàn)白色環(huán)狀沉淀帶，其余管無此種沉淀帶判為陽性。
（四）注意事項
1．反應(yīng)物必須清澈，如不清澈，可離心，取上清液或冷藏后使脂類物質(zhì)上浮，用吸管吸取底層的液體。
2．必須進行對照觀察，以免出現(xiàn)假陽性。
3．采用環(huán)狀沉淀反應(yīng)，用以沉淀素效價滴定時，可將抗原做100×，1 000×，2 000×，4 000×，8 000×等稀釋，分別疊加于抗血清上，以出現(xiàn)環(huán)狀沉淀的zui大稀釋倍數(shù)，即為該血清的沉淀素效價。
三、瓊脂免疫擴散試驗
（一）材料與試劑
1．瓊脂粉
2．平皿
3．打孔器
4．生里鹽水或其他緩沖液，可加1/萬的硫柳汞或疊氮鈉防腐。
（二）操作方法
1．稱取一定量的瓊脂粉，按1%左右（0.8％～1.5%）的比例加入生里鹽水或緩沖液，水浴煮沸融化20min。
2．將融化的瓊脂倒入平皿內(nèi)，使厚度2mm～3mm。自然冷卻。
3．根據(jù)要求（孔徑即孔的直徑，孔距即兩孔圓心之間的距離，包括兩孔的半徑）按模板打孔。也可直接用組合打孔器打孔。現(xiàn)在一般多打成梅花形孔圖。
4．挑出孔內(nèi)瓊脂，注意不要挑破孔緣。
5．在火焰上緩緩加熱，使孔底邊緣的瓊脂少許熔化，以封底，以免加樣后液體從孔底滲漏。
6．以毛細滴管吸取樣品加入孔內(nèi)，注意不要產(chǎn)生氣泡，以加滿為度。加少了，影響反應(yīng)程度，加多了，易溢出，也影響反應(yīng)結(jié)果。
7．加畢后，蓋上平皿蓋，將平皿翻過來，置濕盤中，37℃自由擴散24h～48h。
（三）結(jié)果判定
1．用以檢測抗原或比較抗原差異時，將抗血清置中心孔，將待測抗原或需比較的抗原置于周圍相鄰孔。若出現(xiàn)沉淀帶*融合，證明為同種抗原；若二者有部分相連，表明二者有共同抗原決定簇；若二條沉淀線相互交叉，說明二者抗原*不同，見圖3-1。

圖3-1 瓊脂免疫擴散試驗結(jié)果示意圖
中間孔含A,B,C三種抗血清，a、b和a、c為不同型的抗原（呈雙線或交叉），b、c為同一血清型的不同亞型（部分融合，有交叉）
2．用做血清流行病學調(diào)查時，將標準抗原置中心孔，周圍1、3、5孔加標準陽性血清，2、4、6孔分別加待檢血清。待檢孔與陽性孔出現(xiàn)的沉淀帶*融合者判為陽性。待檢血清無沉淀帶或所出現(xiàn)的沉淀帶與陽性對照的沉淀帶*交叉者判為陰性。待檢孔雖未出現(xiàn)沉淀帶，但兩陽性孔的沉淀帶在接近待檢孔時，兩端均內(nèi)向有所彎曲者判弱陽性。若僅一端有所彎曲，另一端仍為直線者，判為可疑，需重檢。重檢時，可加大檢樣的量。
檢樣孔無沉淀帶，但兩側(cè)陽性孔的沉淀帶在接近檢樣孔時變得模糊、消失，可能為待檢血清中抗體濃度過大，致使沉淀帶溶解，可將樣品稀釋后重檢。
3．用以檢測的抗血清的效價時，將抗原置中心孔，抗血清倍比稀釋后置周圍孔，以出現(xiàn)沉淀帶的血清zui高稀釋倍數(shù)為該抗血清的瓊擴效價。
（四）注意事項
1．不規(guī)則的沉淀線可能是加樣過滿溢出、孔型不規(guī)則、邊緣開裂、孔底滲漏、孵育時沒放水平、擴散時瓊脂變干燥、溫度過高蛋白質(zhì)變性或未加防腐劑導(dǎo)致細菌污染等所致。
2．抗原抗體的比例與沉淀帶的位置、清晰度有關(guān)。如抗原過多，沉淀帶向抗體孔偏移和增厚，反之亦然。可用不同稀釋度的反應(yīng)液試驗后調(diào)節(jié)。
四、瓊脂擴散試驗診斷馬傳染性貧血病
（一）材料與試劑
1．精制瓊脂粉
2．打孔器、加樣器、平皿
3．標準陽性血清和標準陰性血清，由的生物制品廠購買。
4．馬傳染性貧血病瓊脂擴散用抗原，由的生物制品廠購買。
5．pH7.4PBS液
（二）操作方法
1．取瓊脂粉1g，加含有1/萬硫柳汞的PBS液100ml，水浴加熱使之*融化。
2．取平皿（直徑9cm），將融化的瓊脂倒入，每個平皿倒入15ml～18ml，使其厚度約
為2.5mm，冷卻后加蓋，放入4℃～8℃冰箱內(nèi)，至少4h。
3．按7孔梅花圖案打孔，中央孔一個，孔徑4mm，外周孔6個，直徑6mm，孔距8mm
（中間孔至外周孔的中心距離），封底。
4．中央孔加抗原，2、5號孔加標準陽性血清，其余1、3、4、6孔分別加被檢血清，加滿為止。加畢后，平皿加蓋，平放入鋪有數(shù)層濕紗布的帶蓋搪瓷盤內(nèi)，置15℃～30℃條件下孵育。每日觀察一次，連續(xù)3天。
（三）結(jié)果判定
當標準陽性血清孔與抗原之間出現(xiàn)一條明顯致密的沉淀線時，再進行被檢血清孔的判定。
陽性：被檢血清孔與抗原孔之間形成一條沉淀線，或者標準陽性血清的沉淀線末端向內(nèi)彎向毗鄰的被檢血清孔。
陰性：被檢血清孔與抗原孔之間無沉淀線，且標準血清陽性孔與抗原孔之間的沉淀線直向毗鄰的被檢血清孔。
可疑：標準陽性血清孔與抗原孔之間的沉淀線末端似乎彎向毗鄰被檢血清孔，但不易判斷。此種結(jié)果判為可疑。可疑結(jié)果必須進行復(fù)試，將抗原做2×，4×，6×，8×等倍數(shù)稀釋，進行瓊脂擴散，觀察時間可延長至5d，zui后判定結(jié)果。

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