(一)、ABC法：
(注，下面各種方法，均為手工操作，如沒特別說明，均在室溫下進行) 
1.切片經二甲苯Ⅰ 5分鐘。 
2.切片經二甲苯Ⅱ 5分鐘。 
3. *Ⅰ 30秒。 
4. *Ⅱ 30秒。 
5. 95% 酒精Ⅰ 30秒。 
6. 95%酒精Ⅱ 30秒。 
7. 90%酒精 30秒。 
8.80%酒精 30秒。 
9. 70% 酒精 30秒。 
10.自來水洗。(后面的切片脫蠟至水一般都是1-10) 
11.0.3%H2O2甲醇處理切片10-20分鐘。 
12.水洗。 
13.抗原修復。 
14.PBS洗3次，1分鐘/次。 
15.加入血清孵育 20分鐘。 
16.摔干血清，加入一抗60分鐘。 
17.PBS洗3次，2分鐘/次。 
18.加入二抗孵育30分鐘。 
19.PBS 洗3次，2分鐘/次。 
20.加入ABC復合物，孵育30分鐘。 
21. PBS洗3次，2分鐘/次。 
22.DAB-H2O2 孵育切片5-10分鐘。 
23.PBS洗，水洗。 
24.Harris蘇木素染核5-10分鐘。 
25.水洗，分化，藍化，脫水，透明并封固。 
(二)、LSAB法。(SP法)(Labelled streptavidim biotln) 
1.切片脫蠟至水。 
2.0.3%H2O2甲醇處理切片10-20分鐘。 
3.水洗。 
4.抗原修復。 
5.PBS洗3次，1分鐘/次。 
6. 加入血清孵育10分鐘。 
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分鐘。 
8.PBS洗3次，每次2分鐘。加入二抗，孵育20分鐘。 
9.PBS 洗3次，每次2分鐘。 
10.加入SP復合物孵育20-30分鐘。 
11.PBS洗3次，每次2分鐘。 
12.DAB-H2O2孵育5-10分鐘。 
13.PBS洗，水洗。 
14.Harris蘇木素染核5-10分鐘。 
15.水洗，分化 ，藍化，脫水，透明并封固。 
(三)真空負壓LSAB法 
1.切片脫蠟至水。 
2. 0.3%H2O2甲醇真空負壓處理5min. 
3. 水洗。 
4.如果需要，可進行抗原修復。 
5.PBS洗3次，每次1分鐘。 
6.加入正常血清真空負壓處理5min。 
7.摔干血清，加入*抗體，真空負壓處理5分鐘。 
8. PBS洗3次，每次2分鐘。 
9. 加入二抗(即連接抗體)真空負壓處理5分鐘。 
10.PBS洗3次，每次2分鐘。 
11.加入鏈卵蛋白復合物，真空負壓處理 5分鐘。 
12.PBS 洗3次，每次2分鐘。 
13.DAB-H2O2孵育5-10分鐘。 
14.PBS洗，水洗。 
15.染核，分化，藍化，脫水，透明并封固。 
注：真空負壓即將真空干燥中抽成真空。負壓達66.7KPa(500mmHg) 
(四)Envision TM Systems. 
1.切片脫蠟至水。 
2.0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。 
3.水洗。 
4.抗原修復。 
5.PBS 洗3次，每次1分鐘。 
6.加入一抗體孵育30-60分鐘。 
7.PBS洗3次，每次2分鐘。 
8.加入增強劑孵育20-30分鐘。 
9.PBS洗3次，每次2分鐘。 
10.加入酶標抗兔/鼠，復合物，孵育20-30分鐘。 
11.PBS洗3次，每次2分鐘。 
12.DAB-H2O2孵育5-10分鐘。 
13.PBS洗，水洗。 
14.Harris 蘇木素染核5-10分鐘。 
15.水洗，分化，藍化，脫水，透明并封固。 

(五)免疫組化雙染色法。(ⅰ) (Ionmuno- Histochemistry double staimimg method)
1.切片脫蠟至水。 
2.0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。 
3.水洗。 
4.抗原修復。 
5.PBS洗3次，每次1分鐘。 
6.加入非免疫性動物血清，孵育 10分鐘。 
7.PBS洗3次，每次2分鐘。 
8.加入*抗體孵育60分鐘。 
9.PBS洗3次，每次2分鐘。 
10. 加入生物素化的第二抗體，孵育10分鐘。 
11.PBS洗3次，每次2分鐘。 
12.加入鏈卵蛋白素過氧化物酶孵育10分鐘。 
13.PBS 洗3次，每次2分鐘。 
14.加入DAB-H2O2孵育5-10分鐘。 
15.PBS洗3 次，每次2分鐘。 
16. 加入雙染增強液，孵育10分鐘。 
17. 加入非免疫性動物血清孵育10分鐘。 
18. PBS 洗3次，每次2分鐘。 
19. 加入選用的第二種抗體孵育60分鐘。 
20. PBS洗3次，每次2分鐘。 
21. 加入生物素標記的第二抗體孵育10分鐘。 
22. PBS洗3次，每次2 分鐘。 
23. 加入鏈卵蛋白素堿性磷酸酶孵育10分鐘。 
24. PBS洗3次，每次2分鐘。 
25. 加入AEC溶液，孵育5-10分鐘。 
26. 自來水洗。 
27. 蘇木素染核5-10分鐘。 
28. 水性封片。 
注：1. *種復合物也可先用鏈卵蛋白素堿性磷酸酶。 
2.第1次顯色也可用BCIP/NBT溶液，顏色為藍黑色，但應與蘇木素鑒別。 
(六)、免疫組化的雙染色法(ⅱ) (Immuno-histochemistry double staining method) 
1.切片脫蠟至水。 
2.0.3%H2O2 甲醇處理切片10分鐘。 
3.水洗。 
4.抗原修復。 
5.PBS洗3次，每次1分鐘。 
6.加入選用的*抗體孵育 30-60分鐘。 
7.PBS洗3次，每次2分鐘。 
8.加入增強劑孵育20-30分鐘。 
9.PBS洗3次，每次2分鐘。 
10. 加入酶標抗兔/鼠，復合物，孵育 
11.PBS洗3次，每次2分鐘。 
12.加入DAB-H2O2孵育5-10分鐘 
13.PBS洗3次，每次2分鐘。 
14.加入選用的第二種抗體孵育60分鐘。 
15.PBS洗3次，每次2分鐘。 
16. 加入增強劑孵育20-30分鐘。 
17. PBS洗3次，每次2分鐘。 
18. 加入酶標抗兔/鼠堿性磷酸酶復合物孵育20-30分鐘。 
19.PBS洗3次，每次2分鐘。 
20.加入AEC溶液孵育5-10分鐘。 
21.自來水洗。 
22.蘇木素染核5-10分鐘。 
23.水性封片。 
(七)細胞培養片免疫熒光染色法。 
1.將細胞于載片或蓋玻片的片子用理鹽水洗幾次。 
2.純丙酮固定10分鐘。 
3.PBS 浸洗3次，每次1分鐘。 
4.加入選用的*抗體孵育120分鐘。 
5.PBS洗3次，每次2分鐘。 
6.加入熒光抗體孵育60 分鐘以上。 
7.PBS法3次，每次2分鐘。 
8.0.1%伊文氏藍襯染3分鐘。 
9.水洗，蒸餾水洗。 
10. 水性膠封片或用緩沖甘油封片。 
(八)真空負壓免疫熒光染色法染細胞培養片。 
1. 將細胞爬于載玻片或蓋玻片的片子用理鹽水浸洗數次，*洗去蛋白液。 
2.純丙酮固定5-10分鐘。 
3.PBS 浸洗3次，每次1分鐘。 
4.加入選用的*抗體孵育真空負壓處理15分鐘。 
5.PBS洗3次，每次2分鐘。 
6.加入熒光抗體孵育真空負壓處理15分鐘。 
7.PBS洗3次，每次2分鐘。 
8.0.1%伊文氏藍襯染3分鐘。 
9.水洗，蒸餾水洗。 
10. 水性膠封片或用緩沖甘油封片。

子科生物技術部整理編輯！