近年來(lái)，生命科學(xué)研究工具不斷推陳出新，新一代的測(cè)序、成像、自動(dòng)化檢測(cè)等技術(shù)革新了整個(gè)生命科學(xué)行業(yè)的認(rèn)知維度，不僅使得經(jīng)久不衰的科研話題獲得新的突破，如細(xì)胞間相互作用、自噬和細(xì)胞信號(hào)通路等，同時(shí)也為一些過(guò)去無(wú)法解決的難題提供了新思路，例如癌癥新療法CAR-T。本文精選了Nature、Science等高分文獻(xiàn)，探討新一代的成像流式技術(shù)在如下熱門(mén)話題中的應(yīng)用。

免疫細(xì)胞吞噬

細(xì)胞間相互作用一直是免疫學(xué)中的熱點(diǎn)。免疫細(xì)胞可以吞噬靶細(xì)胞從而實(shí)現(xiàn)自我修復(fù)的功能，也可以通過(guò)受體配體結(jié)合實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞間的物質(zhì)交換。由于傳統(tǒng)方法無(wú)法對(duì)單個(gè)細(xì)胞成像，因此細(xì)胞間相互作用的方式一直缺乏直觀有效地證據(jù)。在2009年4月16日，David Sancho等人在Nature上發(fā)表了一篇題為“Identification of a dendritic cell receptor that couples sensing of necrosis to immunity”的文章，成功的證實(shí)了樹(shù)突狀細(xì)胞通過(guò)SKY耦合C型凝集素受體CLEC9A識(shí)別并吞噬壞死細(xì)胞，并且采用量化成像流式技術(shù)識(shí)別并量化統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞吞噬的情況。

圖1：通過(guò)左側(cè)成像流式結(jié)果圖可以清楚的判別細(xì)胞黏連體（’False’ postive）和發(fā)生吞噬的細(xì)胞（’True’ positive），從而排除了假陽(yáng)性結(jié)果的干擾。
 
信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

除了免疫細(xì)胞的吞噬之外，細(xì)胞間的相互作用還包括不同細(xì)胞通過(guò)配體受體的結(jié)合進(jìn)行細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。zui常見(jiàn)的是獲得性免疫反應(yīng)中，T淋巴細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞之間免疫突觸的形成。在正常細(xì)胞中，與免疫突觸形成相關(guān)的蛋白淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（LFA-1），細(xì)胞表面抗原CD3，以及F-actin均勻分布在細(xì)胞表面；而當(dāng)免疫突出形成時(shí)，這些蛋白在兩個(gè)細(xì)胞接觸的位置發(fā)生凝集。正是根據(jù)這一機(jī)制，2009年，Babak H. Hosseini等人成功的使用成像流式技術(shù)檢測(cè)到HEL多肽處理細(xì)胞可以促進(jìn)免疫突觸的形成，并將科研成果發(fā)表在PNAS上。由此也證明成像流式在檢測(cè)免疫突觸形成中*的優(yōu)勢(shì)。

圖2：圖2A顯示，未使用HEL多肽處理的樣本中LFA-1，CD3和F-actin并沒(méi)有發(fā)生凝集，因此沒(méi)有免疫突觸形成。細(xì)胞經(jīng)過(guò)HEL多肽處理后，LFA-1，CD3和F-actin并發(fā)生凝集，證明有免疫突觸形成。圖2B的量化統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，HEL多肽促進(jìn)免疫突觸形成的結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
 
自噬

自噬是細(xì)胞在演變進(jìn)化的過(guò)程中保留下來(lái)的一個(gè)分解代謝過(guò)程，其主要是將胞漿內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸?shù)饺苊阁w內(nèi)進(jìn)而被分解代謝，藉此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。研究自噬的傳統(tǒng)方法主要是通過(guò)熒光顯微鏡或者共聚焦觀察自噬小體/自噬溶酶體的形成。由于顯微鏡的視野限制，無(wú)法進(jìn)行高通量樣本或者混合細(xì)胞樣本，比如臨床血液樣本進(jìn)行分析。2012年，Kanchan Phadwal等人在《Autography》發(fā)表題為“A novel method for autophagy detection in primary cells”使用量化成像流式技術(shù)對(duì)人血中白細(xì)胞旳自噬進(jìn)行了量化分析，并且通過(guò)對(duì)原代細(xì)胞和細(xì)胞系自噬的相關(guān)基因的研究，證實(shí)了T體細(xì)胞的自噬活性明顯高于B細(xì)胞，而隨著DNA損傷水平的升高CD8+ T細(xì)胞的自噬明顯下降。從而為隨著年齡的增長(zhǎng)，免疫系統(tǒng)功能下降提供了合理的解釋。

圖3：由圖可以看出，發(fā)生自噬的細(xì)胞LC3在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的聚集，因此在細(xì)胞內(nèi)，熒光信號(hào)為散點(diǎn)。加了抑制劑（Basal+I）后，自噬被抑制，因此LC3在細(xì)胞內(nèi)是彌散分布的。

CAR-T免疫療法

新型抗腫瘤藥一直都是各大藥企的研發(fā)重點(diǎn)。目前臨床使用的抗癌藥物大多數(shù)為化學(xué)藥，這類(lèi)藥物由于靶向性差導(dǎo)致患者常常會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)以及耐藥性。盡管藥企投入了大量的人力物力，但是不得不承認(rèn)傳統(tǒng)化學(xué)類(lèi)抗腫瘤藥物的研發(fā)遇到了瓶頸。越來(lái)越多的科研人員把目光投向了免疫治療，因此嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法（CAR-T）成為科研界的“寵兒”。不幸的是腫瘤表達(dá)的大多數(shù)抗原不具備腫瘤特異性，因此大多數(shù)的CAR都以腫瘤相關(guān)性抗原作為靶點(diǎn)，但這往往會(huì)導(dǎo)致“脫靶”的可能性。同時(shí)對(duì)于相關(guān)的抗原選擇也需要選擇細(xì)胞表面抗原，以避免CAR-T脫靶的可能。因此尋找腫瘤特異性的細(xì)胞表面抗原成為CAR-T研究的關(guān)鍵。Bryan W. Day等人發(fā)現(xiàn)受體酪氨酸激酶在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）病人中EphA3過(guò)表達(dá)并且通過(guò)調(diào)節(jié)有絲分裂原激活蛋白激酶信號(hào)通路減少腫瘤細(xì)胞的分化。幸運(yùn)的是，作者通過(guò)量化成像流式技術(shù)檢測(cè)到EphA3為細(xì)胞膜蛋白，這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)的CAR-T研究提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

圖4：由成像流式圖像可以看到標(biāo)記熒光的EphA3的分布區(qū)域，主要在細(xì)胞膜上，且在Integrin α6和CD133陽(yáng)性的細(xì)胞中高表達(dá)。 對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，證實(shí)EphA3高表達(dá)是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。

盡管傳統(tǒng)化學(xué)類(lèi)抗腫瘤藥物的研發(fā)遇到了瓶頸，但是由于化學(xué)修飾相對(duì)簡(jiǎn)單方便，并且經(jīng)化學(xué)修飾過(guò)的抗原抗體特異性和親和力都會(huì)有所提高；因此，在CAR-T的研究中化學(xué)修飾依舊有著很大的應(yīng)用潛力。耶魯大學(xué)的Patrick J. McEnaney等人設(shè)計(jì)合成了一類(lèi)被稱為“synthetic antibody mimics targeting prostate cancer (SyAM-P)”的化合物，這類(lèi)中等分子量（~ 7000 Da）的化合物同時(shí)具有抗體的結(jié)合與效應(yīng)能力，因此可以有效的將免疫細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞特異性地結(jié)合在一起，從而增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的特異性識(shí)別和吞噬。這一發(fā)現(xiàn)于2014年12月16日發(fā)表在化學(xué)類(lèi)的雜志JACS上，為CAR-T的研究提供了新思路。

圖5：通過(guò)成像流式可區(qū)分發(fā)生吞噬的細(xì)胞，吞噬形成圖（右下）顯示SyAM-P可以幫助免疫細(xì)胞識(shí)別癌細(xì)胞；吞噬完成圖（右上）證明免疫細(xì)胞可以吞噬癌細(xì)胞。左圖量化分析顯示此結(jié)果是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，我們不難發(fā)現(xiàn)，單一的圖像或者單一的群體統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)已經(jīng)無(wú)法滿足科研的需要。尤其是在醫(yī)療飛速發(fā)展的時(shí)代，科學(xué)家們要獲得質(zhì)量更高、更為可信的數(shù)據(jù)，為臨床的診斷和治療提供有力的支持。因此不僅需要科研工作者們將個(gè)體數(shù)據(jù)與群體數(shù)據(jù)的有機(jī)結(jié)合，還要通過(guò)“眼見(jiàn)為實(shí)”的圖像證實(shí)所獲得的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果是有意義的。量化成像流式技術(shù)將流式細(xì)胞檢測(cè)與熒光顯微成像結(jié)合于一體，既能提供細(xì)胞群的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，又可以獲得單個(gè)細(xì)胞的圖像，從而提供了細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞信號(hào)分布的完整信息，這預(yù)示著該技術(shù)在未來(lái)科研領(lǐng)域中無(wú)限的應(yīng)用潛力！