磷酸鈣轉染法的原理是通過DNA，氯化鈣與磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA的極小不溶解的磷酸鈣顆粒。這些磷酸鈣顆粒會粘結到細胞膜上通過胞飲作用進入細胞中，從而達到外源質粒轉染進入細胞的目的。磷酸鈣轉染法主要用于慢病毒包裝。由于慢病毒包裝需要的質粒量大，脂質體用量大，可能會影響細胞狀態。而磷酸鈣沉淀法因為試劑易取得、價格便宜而被廣泛應用。

磷酸鈣轉染法實驗過程

1. 轉染前24小時選擇狀態良好的293T細胞傳代， 4×10^6個細胞接種于10cm 細胞培養皿中。

2. 20-24h后，待細胞長至鋪滿細胞皿底約40-50%的時候，進行轉染。

A：取1.5mlEP管，加入質粒：

Lentivirus vector： 10ug

VSVG 質粒 5ug

REV 質粒 5ug

選擇超純水補至100ul。

向上述DNA溶液中加入50ul 2 M CaCl2 溶液，輕輕吹吸混勻。

B．向上述液體中逐滴加入2XHBS，立即吹打混勻在至呈現乳白色?；蛘哌x用電動移液槍，一邊滴加，一邊用電動移液槍進行吹打。不要超過一分鐘。

C．將制備的混懸液室溫放置10-15分鐘。

D．將制備的混懸液輕輕地均勻滴入培養皿，輕輕搖勻后置于培養箱中，6-8h后換液。

因為在吹打混勻液體過程中，每個人的吹打力度不同，因此在制備混合液后可以取載玻片置于顯微鏡下，滴加一滴混合液，觀察些顆粒大小。以便摸索實驗的合適條件。

3、轉染12至16小時之后給293T細胞換液。

4、轉染48小時之后，如果質粒帶有熒光標簽，可以通過觀察熒光判斷轉染效率。同時收集293T細胞的培養基, 3000rpm離心10分鐘去除細胞碎片。

5、將離心后上清進行分裝，如果一周內使用，可以臨時放于4度冰箱。將其他分裝的上清凍存于－80度冰箱中。因為病毒上清反復凍融，會造成病毒的滴度明顯下降。

相關實驗試劑配制

一.2XHBS（100ml）：

NaCl: 1.636g,終濃度280mM

KCl:0.074g, 終濃度10mM

Na2HPO4: 0.0537g, 終濃度1.5 mM

Glucose：0.2g, 終濃度12 mM

HEPES：1.19g, 終濃度50 mM

調節pH范圍在7.00- 7.45過濾分裝后進行滅菌。

二.2M CaCl2(100ml)：

稱取29.4g CaCl2-H2O，加入超純水，過濾分裝后進行滅菌。