人或動(dòng)物體內(nèi)（或胚胎）的組織，將其剪碎至1mm3的組織塊，再采用如下方法進(jìn)行原代細(xì)胞分離培養(yǎng)：

一、懸浮細(xì)胞的分離方法

1、將血液、羊水、胸水或腹水等懸液直接轉(zhuǎn)至離心管中，1000rpm/分鐘離心5分鐘。

2、去掉上清，離心沉淀用無(wú)鈣、鎂的PBS清洗后1000rpm/分鐘離心5分鐘。此步重復(fù)兩次。

3、用培養(yǎng)基重懸，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后分瓶培養(yǎng)。

4、如選用懸液中某種細(xì)胞，可采用離心后的細(xì)胞分層液收獲目的細(xì)胞。

二、實(shí)體組織材料的分離方法

（一）機(jī)械分散法

1、纖維成分很少的腦組織，部分胚胎組織，用剪刀剪碎至1mm3的組織塊。

2、用PBS清洗兩次后

①用吸管吹打，分散組織細(xì)胞。

②或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)（用九號(hào)針），使細(xì)胞通過(guò)針頭壓出。

③或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物（注射器鈍端）壓擠使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。

3、收集細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm/分鐘離心5分鐘。

4、去上清，加入含血清的培養(yǎng)基，重懸后移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

（二）消化分離法

1、酶消化分離法（過(guò)夜冷消化法）

①細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等，用Hanks液清洗組織三次，剪成碎塊大小為4毫米左右。

②再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪組織。

③加入0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放4℃過(guò)夜。

④次日再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗2-3次。

⑤加入少量含血清的培養(yǎng)基吹打分散，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。

2、非酶消化法（EDTA消化法）

①把組織塊剪碎，呈1mm3大小的組織塊。

②將碎組織塊在平皿中用無(wú)鈣鎂PBS洗2-3次。

③加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或EDTA）于37℃水浴中作用適當(dāng)時(shí)間（中間可輕搖1~2次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。

④棄去上清，加入含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基中止消化反應(yīng)，并洗滌2-3次后，加入*培養(yǎng)基。

⑤用吸管吹打，使細(xì)胞充分散開(kāi)后用紗網(wǎng)過(guò)濾后分瓶培養(yǎng)。
 

（三）原代細(xì)胞培養(yǎng)

原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。由于細(xì)胞剛剛從活體組織分離出來(lái)，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、繁殖提供有力的手段，同時(shí)也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。利用此方法還可直接服務(wù)于臨床實(shí)踐。例如，用從手術(shù)中切除的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，然后用該培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行抗癌藥物的篩選，根據(jù)腫瘤細(xì)胞對(duì)加入的化療藥物的敏感性來(lái)幫助選擇有效的化療方案，有可能起到增強(qiáng)療效、降低副作用的作用。

（四）原代細(xì)胞的傳代、保存

（1）傳代：依椐細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，生長(zhǎng)的細(xì)胞1：2或1：3進(jìn)行傳代。

（2）保存：DMSO＋培養(yǎng)液＋血清

按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘）→冰箱冷凍室（30分鐘）→超低溫冰箱（－80℃  過(guò)夜）→液氮。

（五）原代細(xì)胞的復(fù)蘇

（1）取出細(xì)胞，迅速放入37℃溫水中快速解凍。

（2）吸出細(xì)胞懸液，并加10倍以上培養(yǎng)液。

（3）用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后接種培養(yǎng)瓶，放入37℃ CO2 培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。