通用型細菌鑒定16S rDNA PCR擴增檢測試劑盒產品說明書(中文版)
主要用途
通用型細菌鑒定16S rDNA PCR擴增檢測試劑是一種旨在根據保守性序列設計引物，針對微生物樣本DNA進行PCR擴增，進一步測序后借助分析工具予以同源比較，由可變序列識別和分類微生物樣品的而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。可以被用于各種微生物的鑒定、歸類、建樹等系統微生物學的研究。產品即到即用，性能穩定，操作簡便，擴增效率顯著。
技術背景
16SrRNA作為非培養依賴性標記的分子指模（fingerprinting）技術，有別于傳統的選擇性培養技術，用于研究微生物的分類學（phylogenetics）。核糖體RNA（ribosome RNA）存在于所有微生物體內，且結構與功能進化保留；容易分離和識別；其一級和二級結構具有高度進化保守區域（conserved region）和物種特異性可變區域（variable region）；其基因序列變異非常緩慢，且不會發生平行基因轉移（horizontal gene transfer）。其包括5S、16S、23S。5S信息量不夠充分；23S不穩定；而微生物16SrRNA基因較為穩定，初級結構含有1500個堿基。通過引物設計，擴增產物測序，數據庫對照，鑒定微生物的類別或建立新的微生物在進化樹上的位置。
產品內容
擴增液（Reagent A） 微升
引物液（Reagent B） 微升
補充液（Reagent C） 毫升
測序引物A（Reagent D） 微升
測序引物B（Reagent E） 微升
產品說明書 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里；有效保證6月
用戶自備
PCR級礦物油：用于封隔反應液
PCR儀：用于樣品擴增
PCR管或平板：用于PCR反應的容器
瓊脂糖凝膠電泳：用于擴增后電泳分析
實驗步驟
實驗開始前，從－20℃冰箱中取出試劑，放進冰槽里融化。然后進行下列操作： 1
300
40
20
20
7
加入2
1． 針對一個樣本，每次移出 15 微升 擴增液（Reagent A）到 PCR 管
2． 加入 1 微升用戶自備的的待測 DNA 樣品（總量 100 納克）
3． 微升 引物液（Reagent B）
4． 再加入 微升 補充液（Reagent C）（反應總量為 25 微升）
5． 即刻放進微型臺式離心機瞬時離心 5秒，速度為500g（或2000RPM；例如 eppendorf 5415）
6． （選擇步驟）加入 50微升用戶自備的 PCR 級礦物油（注意：參見注意事項 13）
7． 即刻進行熱啟動 PCR 反應：
溫度（℃）
時間
循環
95
2分鐘
1
95
45
70
1分鐘
1分鐘
1分鐘
30
70
5分鐘
8． 反應完畢后，移取5微升進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳：產物為1.5kb左右
9． 如果繼續測序鑒定，膠回收PCR產物（建議使用）
10．分別移出2微升用戶自備的測序反應液到2個不同的新的1.5毫升離心管
11．加入1微升測序引物A（Reagent D）到其中一個1.5毫升離心管，作好標記
12．加入1微升測序引物B（Reagent E）到另一個1.5毫升離心管，作好標記
13．進行后續的測序反應
注意事項
1． 本產品為20次操作
2． 操作時，須戴手套
3． 建議使用帶濾芯的槍頭，避免污染
4． 在－20℃冰箱里儲存的產品避免反復凍融
5． 建議樣品為純培養微生物的DNA；DNA提取應確保高純度
6． 可以使用菌落直接檢測：用無菌槍頭點觸
7． 如果沒有擴增條帶，可以直接測序，或詢問特殊引物設計服務
8． 可以直接使用純化的基因組DNA進行測序
9． 可以將擴增產物純化后，克隆到質粒中，然后進行測序
10．測序引物A（Reagent D）為上游引物，可以獲得500至1500的序列；引物序列為：
5－CAGCAGCCGCGGTAATAC3
11．測序引物B（Reagent E）為下游引物，可以獲得0至500的序列；引物序列為：
5－GTATTACCGCGGCTGCTG－3
12．測序建議優先使用測序引物B（Reagent E），其可變區域較為特征
13．根據用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
14．建議使用軟件測算Tm溫度；參考公式為Tm=4（G+C）+2（A+T）
15．本公司提供16SrDNA特異性引物設計服務
16．測序后，序列分析和微生物分類分析工具參考如下：
1）樣品序列與數據庫已知微生物序列的比對（BLAST） 2
高質純化膠回收試劑盒
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
2）樣品序列的分類學分析前的預編輯
http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/docs/biosoft-free.html
3）樣品的進化樹的確立
http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html
http://www.lms.si.edu/PAUP
4）16SrRNA 數據庫
http://www.mikro.biologie.tu-muenchen.de
17．本公司提供系列細菌 16S rDNA 擴增檢測試劑產品
質量標準
1． 本產品經鑒定性能穩定
2． 本產品經鑒定無核酶污染
3． 本產品經鑒定檢測準確