細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧單線態(tài)氧氣比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
主要用途
細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧單線態(tài)氧氣比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)二甲基-4-亞硝基苯胺，受到單線態(tài)
氧氣-的作用，出現(xiàn)去色現(xiàn)象，由分光光度儀比色分析，定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧氣活性氧族的生成和增加
的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰
老、代謝和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，檢測(cè)敏感。
技術(shù)背景
超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基
（hydroxyl radical；OH-）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧
自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）
次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等
細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。其中單線態(tài)氧
氣（singlet oxygen；1 O2）是分子氧（O2）的抗磁形式或電激發(fā)形式。通過(guò)染料分子，例如孟加拉紅（Rose
Bengal）、亞甲基蘭（Methylene Blue）、卟啉類化合物（Porphyrins）染料的光敏過(guò)程中能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生，或過(guò)
氧化氫和次氯酸的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生。單線態(tài)氧氣可以調(diào)節(jié)紫外線A輻射的生物學(xué)作用、激活各種細(xì)胞信號(hào)通
路等。單線態(tài)氧氣會(huì)導(dǎo)致植物的光動(dòng)力損傷（photodynamic damage）和動(dòng)物心血管問(wèn)題。基于二甲基-4-亞
硝基苯胺（N,N-Dimethyl-p-nitrosoaniline；PNDA或RNO）作為單線態(tài)氧氣的選擇性受體，在單線態(tài)氧氣的
存在下，產(chǎn)生去色作用，在分光光度儀下（440nm波長(zhǎng)），呈現(xiàn)吸光峰值的降低。據(jù)此定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)單線
態(tài)氧氣活性氧族的濃度。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
反應(yīng)液（Reagent D） 毫升
陰性液（Reagent E） 毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)1 份
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）避免光照；有
效保證6 月
用戶自備
1.5 毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15 毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育
比色皿或酶標(biāo)板：用于比色分析的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、樣品準(zhǔn)備
1. 準(zhǔn)備好25cm2 細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1 至5 X 106 細(xì)胞）
2. 小心加入xx 毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）
5. 加入xx 毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
6. 移入到預(yù)冷的15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）
7. 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx 微升裂解液（Reagent B），充分混勻
10. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5 毫升離心管
1． 強(qiáng)力渦旋震蕩15 秒
11. 置于冰槽里孵育30 分鐘
12. 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13. 小心移取500 微升上清液到新的預(yù)冷的1.5 毫升離心管
14. 移取10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)
15. 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、測(cè)定準(zhǔn)備
1． 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)440nm，并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent D）避免光照
三、背景對(duì)照測(cè)定
1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx 微升陰性液（Reagent E）
3． 加入xx 微升反應(yīng)液（Reagent D）
4． 上下傾倒數(shù)次，混勻
5． 在30℃溫度下孵育40 分鐘
6． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照
四、樣品測(cè)定
1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入100 微升待測(cè)樣品（50 微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
3． 加入xx 微升反應(yīng)液（Reagent D）
4． 上下傾倒數(shù)次，混勻
5． 在30℃溫度下孵育40 分鐘
6． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)
五、計(jì)算樣品濃度
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1 （體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.1（樣品容量；毫升）X 34.4（毫摩
爾吸光系數(shù)）]＝微摩爾1 O2/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝微摩爾1 O2/毫克
六、酶標(biāo)板測(cè)定
1． 在96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
2． 分別移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到96 孔板的所有孔中
3． 分別加入xx 微升陰性液（Reagent E）或待測(cè)樣品（20 微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
4． 分別加入xx 微升反應(yīng)液（Reagent D）到96 孔板的所有孔中
5． 輕輕搖動(dòng)96 孔酶標(biāo)板
6． 在30℃溫度下孵育40 分鐘
7． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
8． 濃度計(jì)算：
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25 （體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.025（樣品容量；毫升）X 34.4
（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（厘米）]＝微摩爾1 O2/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝微摩爾1 O2/毫克
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為20 次（比色皿）或80 次（酶標(biāo)板）操作
2． 避免使用*處理樣品
3． 操作時(shí)，須戴手套
4． 孵育時(shí)，避免光照
5． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1 次
6． 建議使用比色皿測(cè)定
7． 樣品須澄清，至關(guān)重要
8． 測(cè)定值由高到低變化
9． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
10．建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50 微克/100 微升；如果樣本濃度過(guò)低或過(guò)高， 則可以增加或降低樣本量
11．如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
12．可以使用單線態(tài)氧氣抑制劑或清除劑（scavenger），即NaN3 和DABCO 作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照
13．可以使用單線態(tài)氧氣激發(fā)劑（generator），即萘啶酮酸（Nalidixic acid）等作為陽(yáng)性對(duì)照
14．本公司提供系列活性氧檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感