如果有人告訴你用顯微鏡實時觀測單分子DNA聚合酶復制DNA，并用它來測序，你一定會認為他異想天開，沒有一點生物的sense。

我zui初就是這樣認為的，然而它不僅可以實現，而且已經實現了！這個就是被稱為第三代的測序技術，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time （SMRT™） DNA Sequencing”（單分子實時DNA測序）。

我有幸在NIH聽到了這個技術發明人Stephen Turner博士的講座，根據自己粗淺的理解記錄整理一下。

要實現單分子實時測序，有三個關鍵的技術。

*個是熒光標記的脫氧核苷酸。顯微鏡現在再厲害，也不可能真的實時看到“單分子”。但是它可以實時記錄熒光的強度變化。當熒光標記的脫氧核苷酸被摻入 DNA鏈的時候，它的熒光就同時能在DNA鏈上探測到。當它與DNA鏈形成化學鍵的時候，它的熒光基團就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標記的脫氧核苷酸不會影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈*一樣。

第二個是納米微孔。因為在顯微鏡實時記錄DNA鏈上的熒光的時候，DNA鏈周圍的眾多的熒光標記的脫氧核苷酸形成了非常強大的熒光背景。這種強大的熒光背景使單分子的熒光探測成為不可能。Pacific Biosciences公司發明了一種直徑只有幾十納米的納米孔[zero-mode waveguides （ZMWs）]，單分子的DNA聚合酶被固定在這個孔內。在這么小的孔內，DNA鏈周圍的熒光標記的脫氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G這四種熒光標記的脫氧核苷酸非常快速地從外面進入到孔內又出去，它們形成了非常穩定的背景熒光信號。而當某一種熒光標記的脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時，這種特定顏色的熒光會持續一小段時間，直到新的化學鍵形成，熒光基團被DNA聚合酶切除為止（見圖）。
 

第三個是共聚焦顯微鏡實時地快速地對集成在板上的無數的納米小孔同時進行記錄。由于我對顯微原理的物理知識匱乏，而Pacific Biosciences公司又沒有非常強調在這方面的發明，不做進一步探討。

他們還對這一技術進行進一步的優化。

*個是把雙鏈DNA環化反復測序。人們可以在雙鏈DNA的兩頭連上發夾結構的DNA adaptor，從而使DNA環化。而DNA聚合酶就能夠以環化的DNA作為模板滾環復制，反復測一段DNA序列。這種反復測序，糾正了偶爾出現的復制錯誤，從而使測序精度非常高。

第二個是激發光中斷測序法。DNA聚合酶雖然很穩定，但是在強大的激發光作用下酶也是有一定壽命的。如果把激發光中斷一段時間，在這段時間內DNA聚合酶繼續復制DNA，當激發光重新開啟以后，人們就可以測到長DNA鏈后面的序列。

第三代測序技術非常可怕。1、它實現了DNA聚合酶內在自身的反應速度，一秒可以測10個堿基，測序速度是化學法測序的2萬倍。2、它實現了DNA聚合酶內在自身的processivity（延續性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長的片段），一個反應就可以測非常長的序列。 二代測序現在可以測到上百個堿基，但是三代測序現在就可以測幾千個堿基。這為基因組的重復序列的拼接提供了非常好的條件。3、它的精度非常高，達到 99.9999%。

此外，它還有兩個應用是二代測序所不具備的。

*個是直接測RNA的序列。既然DNA聚合酶能夠實時觀測，那么以RNA為模板復制DNA的逆轉錄酶也同樣可以。RNA的直接測序，將大大降低體外逆轉錄產生的系統誤差。

第二個是直接測甲基化的DNA序列。實際上DNA聚合酶復制A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時間不同。根據這個不同的時間，可以判斷模板的C是否甲基化。

Pacific Biosciences公司預計2010年或者2011年就會推出商業化的測序儀器。在不遠的將來，如果他們能和二代測序一樣集成100萬個納米微孔，那么一臺儀器15分鐘就能夠準確地測出一個人的基因組。以后每個人的基因組測序成本將變成100美元，人人都可以消費得起。想想人類基因組計劃耗資30億美元，費時十幾年，無數科學家參與其中，技術的革新意義是多么重大啊！

介紹完三代測序技術之后，請允許我販賣點私貨：

1、創新創新再創新。國內多數導師為了掩飾自己idea的匱乏，極力壓制學生的冒險欲望，鼓勵學生對一個小的問題花無數的時間用data堆成文章。其實想做真正有挑戰性的課題的想法是非常可貴的，導師一個很重要的功能是幫助學生評估他們想法的可行性，在可行的情況下盡量提供條件讓他們自己去闖。從想做真正科研的學生的角度來說，讓那些不能激動你的保險課題見鬼去吧，花大力氣去尋找一些真正能貢獻科學，貢獻社會的課題，不要害怕一時的挫折，這是科研的真意！

2、不要鄙視公司。有很多人以為學院派的科研是的，其實真正推動科學進步的絕不僅僅是發生在學校和研究所的科研。公司同樣能做非常令人暈眩的研究，經濟意義，社會效益有時候恐怕遠甚于學院派研究。美國的許多應用研究就是在公司里面完成的。

3、學科交叉。緊咬你的可貴想法，然后橫跨各個學科，自己學或者尋合作者。光是生物背景，想要發明第三代測序技術，那就是個笑話。