來自哈佛-麻省理工Broad研究所的研究人員，近日將5種不同的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）法進行了對比，比較結(jié)果顯示RNase H技術(shù)在分析低質(zhì)RNA樣品方面優(yōu)于其他技術(shù)，且價格zui為便宜；SMART和NuGEN法適應(yīng)于分析少量RNA。2篇研究論文在線發(fā)表在5月19日的《自然》（Nature）和《自然方法》（Nature Methods）雜志上。
論文的共同作者、哈佛-麻省理工Broad研究所研究助理Xian Adiconis說：“RNA在一段時間內(nèi)會發(fā)生降解，我們一直在尋找一種方法來解決這一問題。我們嘗試了不同的方法，zui終我們發(fā)現(xiàn)RNase H法很好用，能夠給出一致的結(jié)果。”
RNA-seq是一種利用高通量序列測定，來測序和定量RNA進行轉(zhuǎn)錄組分析的方法。然而當(dāng)研究人員利用少量降解或少量殘存的樣本進行RNA-seq時，他們得到的是受損的結(jié)果。Adiconis說，當(dāng)前有許多的方法和商業(yè)試劑盒可用于分析低質(zhì)和低量的樣本，但直到現(xiàn)在人們也只能在某種程度上依靠猜測對這些方法進行選擇。
在*篇Nature Methods論文中，該研究小組通過測試這些技術(shù)清除低質(zhì)樣本中核糖體RNA（rRNA）的能力，發(fā)現(xiàn)RNase H能夠清除低質(zhì)樣本中幾乎所有的rRNA，只有1%的量殘存。而Ribo-Zero法留下了11.3%,的rRNA，NuGEN法留下了23.2%。此外，對于低質(zhì)RNA，RNase H和Ribo-Zero法在大多數(shù)量度，例如文庫復(fù)雜性（樣本中文庫復(fù)雜性越高，就越能更好地代表RNA）和覆蓋均勻度等方面看起來更優(yōu)。
研究小組隨后采用真實樣本：一個福爾馬林固定、石蠟包埋的腎樣本，以及一個分離過程中發(fā)生了降解的胰腺樣本，比較了RNase H 和Ribo-Zero。zui終，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)RnaseH優(yōu)于Ribo-Zero，提供了略微更均勻的覆蓋。
鑒于它們在特異針對性清除rRNA序列方式上的根本差異，總體而言，RnaseH和Ribo-Zero優(yōu)于其他的方法。例如，RnaseH法是采用預(yù)先設(shè)計的DNA寡核苷酸結(jié)合核糖體RNA序列，隨后RNase H酶消化DNA-RNA雜交物。“這種靶向性的方法相對不影響剩余的轉(zhuǎn)錄組，”論文的共同作者、Broad研究所博士后Rahul Satija說。
相比之下，其他的方法，如polyA篩選法、DSM和SMART，是通過篩選多聚腺苷酸mRNA（poly-adenylated mRNA）或是清除高度豐富的RNA種類的方法，來間接清除核糖體RNA。這些技術(shù)在清除核糖體RNA的同時，也引入了降解樣品覆蓋偏倚。
此外，Ribo-Zero、NuGEN和SMART商業(yè)試劑盒一個樣本的成本，要大大高于DSN-lite和RNase H等其他方法。組裝這些文庫所需的勞動量大致相同，除了DSN-lite需要多一天之外。
盡管RNase H看起來是一個明顯的贏家，一種方法的選擇要主要是取決于研究目的。例如，NuGEN能夠*地應(yīng)用于非常量小的樣本。“我們測試是1 ng和100 ng的樣本量，但實際NuGEN方法可以達(dá)到比這更低。它也非常適用于已經(jīng)降解的RNA，”Adiconis說。
SMART方法也適用于微小樣本，不過其要求RNA必須是完整的。在另一項發(fā)表在Nature雜志上，Adiconis和同事們利用SMART方法對單個免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進行了測序，揭示了這些單細(xì)胞在基因表達(dá)上的異質(zhì)性。
該研究小組過去一直采用NuGEN來測量單個病毒顆粒的轉(zhuǎn)錄組，單個病毒顆粒的RNA量不超過1皮克。“但我們從未嘗試過用NuGEN法來檢測單細(xì)胞，因此我們不能說它更好一些，”兩項新研究的共同、基因組測序和分析項目部（GSAP）Joshua Levin說。
