[實(shí)驗(yàn)原理]
感受態(tài)是指細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)人細(xì)菌的過(guò)程。其原理是細(xì)菌處于0℃，CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基—鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時(shí)間，促使在轉(zhuǎn)化過(guò)程中獲得的新的表型（如Ampr等）得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐*的選擇性培養(yǎng)基上。
重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，還需對(duì)轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行篩選鑒定。利用α互補(bǔ)現(xiàn)象進(jìn)行篩選是zui常用的一種鑒定方法。現(xiàn)在使用的許多載體都具有一段大腸桿菌β半乳糖苷酶的啟動(dòng)子及其編碼α肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱為lacZ'基因。lacZ'基因編碼的α肽鏈?zhǔn)?beta;半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146個(gè)氨基酸）。任何攜帶著lacZ'基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化了染色體基因組存在著此種β半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細(xì)胞后，便會(huì)產(chǎn)生出有功能活性的半乳糖苷酶，在IPTG（異丙基β—D—硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)后，在含有Xgal（5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷）的培養(yǎng)基平板上形成藍(lán)色菌落（半乳糖苷酶能將無(wú)色的化合物Xgal切割成半乳糖和深藍(lán)色的底物5-溴-4-靛藍(lán)）。而當(dāng)有外源DNA片段插入到位于lacZ'中的多克隆位點(diǎn)后，就會(huì)破壞α肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內(nèi)突變的β半乳糖苷酶相互補(bǔ)的活性α肽，而導(dǎo)致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，也就不能分解Xgal而顯藍(lán)色，因此含有重組質(zhì)粒載體的克隆往往是白色菌落。
[儀器、材料與試劑]
（一） 儀器和材料
超凈工作臺(tái)、低溫離心機(jī)、恒溫?fù)u床、恒溫箱、恒溫水浴、離心管、試管、培養(yǎng)皿、錐形瓶、接種針、玻璃涂棒、酒精燈、鑷子、牙簽、大腸桿菌DH 、質(zhì)粒
（二） 試劑
0.1mol／L CaCl2溶液 LB液體培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基
氨芐*（Amp）：用無(wú)菌水配制成100mg／mL溶液，置—20℃冰箱保存。
Xgal：將Xgal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg／mL，不需過(guò)濾滅菌，分裝小包裝，避光貯存于-20℃。
IPTG：取2g IPTG溶于8mL雙蒸水中，再用雙蒸水補(bǔ)至10mL，用0.22um濾膜過(guò)濾除菌，每份1mL，貯存于-20℃。
[實(shí)驗(yàn)步驟]
（一） 制備感受態(tài)細(xì)胞
1、吸取15µl E.coil菌液，接種于20ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，待OD600=0.5左右將該菌懸液以1：50接種量轉(zhuǎn)于50ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔20-30min測(cè)一次OD600，至OD600=0.6左右，停止培養(yǎng)。
2、培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，在冰浴10min，4℃下5000rpm離心10min。
3、棄上清液，用4ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2溶液輕輕懸浮菌體至均勻，冰上放置30min。
4、4℃下5000rpm離心6min。
5、棄上清液，用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2溶液輕輕懸浮菌體至均勻，冰上放置片刻后即制成感受態(tài)細(xì)胞懸液。
6、以上制好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可在冰上放置，24小時(shí)內(nèi)直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，也可加入15%高壓滅菌過(guò)的甘油，混勻后，分裝于1.5ml離心管中，每管100µ l感受態(tài)細(xì)胞懸液，置-70℃條件下保存。.
（二） 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌
1、取100µl搖勻后的感受態(tài)細(xì)胞懸浮液（如是冷凍保存液，則需化凍后馬上進(jìn)行下面的操作），加入5µl連接產(chǎn)物，輕輕搖勻，冰上放置30min后，于42 IPTG水浴中保溫90s，然后迅速在冰上冷卻2min。
2、加入900µl LB液體培養(yǎng)基，則總體積約1ml，混勻于37℃振蕩培養(yǎng)90分鐘使受體菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)并使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗藥性Ampr。
3、在預(yù)制的LB瓊脂平板上，加40uL 20mg／mL的Xgal和4uL 200mg／mL的IPTG溶液，并用滅菌玻璃推子（酒精燈上燒后冷卻），均勻涂布于瓊脂凝膠表面，37℃倒置吸收。
4、將恢復(fù)培養(yǎng)的菌體4000rpm離心5min，移去上層900µl LB培養(yǎng)基，用余下的100µl重懸菌體至均勻。
（四） α互補(bǔ)現(xiàn)象的檢查
將重懸菌體均勻涂布于含X-gal+IPTG+氨芐*的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)12—24h，出現(xiàn)菌落。其中白色菌落從理論上講為重組克隆。
如果進(jìn)一步驗(yàn)證，可挑取多個(gè)白色菌落分別接種到1ml含有氨芐*的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)6-8h，然后提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，或進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增鑒定。
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