M單核細胞趨化和激活因子MCAF 酶聯免疫/酶免法（ELISA 試劑盒）

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ELISA試劑盒組成及試劑配制

1. 酶聯板：一塊（96孔）

2. 標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為1,600 pg/ml，將其稀釋為400 pg/ml后，再做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別稀釋成400 pg/ml，200 pg/ml，100 pg/ml，50 pg/ml，25 pg/ml，12.5 pg/ml，6.25 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內配制。如配制200 pg/ml標準品：取0.5ml （不要少于0.5ml ） 400 pg/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3. 樣品稀釋液：1×20ml。

4. 檢測稀釋液A：1×10ml。

5. 檢測稀釋液B：1×10ml。

6. 檢測溶液A：1×120μl（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（100μl/孔），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl檢測溶液A加990μl檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。

7. 檢測溶液B：1×120μl/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8. 底物溶液：1×10ml/瓶。

9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

11. 覆膜：5張

12. 使用說明書：1份

  Elisa試劑盒實驗操作步驟：

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。

1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100μl（在使用前一小時內配制），酶標板加上覆膜, 37℃反應60分鐘。

3.  溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。

4. 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100μl，酶標板加上覆膜37℃反應60分鐘。

5. 溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內液體拍干）。

6. 依序每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。

8. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進行檢測。

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