克倫特羅（Clenbuterol）定量檢測試劑盒（ELISA）

使用說明書

一、概要

克侖特羅（Clenbuterol）屬于β-興奮劑，是一種高選擇性的興奮劑和激素，具有水解脂肪、合成代謝和對非條紋肌肉組織的松弛作用。近年來被非法添加到飼料中以提高脂肪型動物的瘦肉率和加速動物生長，因其添加劑量是治療劑量的5-10倍，以至于在動物體內殘留而給消費者帶來危害。

通常情況下，HPLC或GC-MS是克倫特羅殘留檢測的確證方法，但是其前處理步驟繁瑣、費用昂貴。酶聯免疫快速檢測試劑盒具有成本低廉、操作簡便、一次處理樣本量大等優點，已成為常規的初步篩查方法。本試劑盒是應用ELISA技術研發的新一代藥物殘留檢測產品，與儀器分析技術相比具有快速、簡便、準確和靈敏度高等特點，能zui大限度地減少操作誤差和工作強度。

二、用途

定量檢測動物尿液中克侖特羅（Clenbuterol）的殘留。

三、檢測原理

本試劑盒采用競爭酶聯免疫試驗。檢測的基礎是抗原抗體反應，微孔板預包被羊抗鼠IgG捕獲抗體，加入鼠抗克倫特羅抗體后，會與捕獲抗體連接。經過孵育及洗板后，加入標準品、樣品及克倫特羅酶標記物（Clen-HRP），游離的克倫特羅（Clen）與克倫特羅酶標記物（Clen-HRP）競爭克倫特羅抗體結合位點。經過孵育及洗板后，加入底物并孵育。結合的酶連接物將底物轉化為藍色的產物。加入反應終止液后使顏色由藍轉變為黃色。在450 nm 處測量，吸光度值與樣品中的克倫特羅濃度成反比，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣品中克侖特羅的含量。

四、檢測限

檢測限：0.03ng/ml（0.03ppb）

五、特異性

克侖特羅 ……………………………………………*

* …………………………………………約10%

他林 …………………………………………小于10%

非諾特羅 ……………………………………………小于1%

馬布特羅 ……………………………………………約30%

西馬特羅 ……………………………………………小于1%

溴布特羅 ……………………………………………約92%

塞曼特羅 ……………………………………………小于1%

異丙腎上腺素 ………………………………………小于1%

六、試劑盒組成

每一個盒中的試劑足夠進行 96 個試驗（包括標準測定），試劑盒中的組份如下：

1、96孔酶標板1塊（12孔×8條）：預包被羊抗鼠IgG

2、標準液×6瓶（1ml/瓶）：

0ng/mL、0.03ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL

3、酶標記物（6mL）：辣根過氧化物酶標記的克倫特羅工作液

4、克倫特羅抗體（10mL）：鼠抗克倫特羅單克隆抗體工作液

5、底物液A（6mL）：過氧化脲

6、底物液B（6mL）：四甲基聯苯胺（TMB）

7、終止液（6mL）：2N H₂SO₄

8、濃縮洗滌液（20×）（25mL）：含Tween-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）

9、其他：封板膜3張，自封袋1個，說明書1份

七、樣本處理

處理任何樣本，必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。取50μL清亮尿樣直接測定，如尿樣渾濁3000轉離心10min，取上層清亮尿液測定，暫不使用的樣本應于-20℃冷凍保存。

八、檢測步驟

仔細的洗滌非常重要。避免在操作過程中微孔出現干燥。

1、將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上。

2、準備：取出需要數量的微孔板，將用剩的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。將微孔板條插入微孔架，標準品和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準品和樣品的位置。

3、加抗體：每孔加入100μL抗體溶液，37℃恒溫箱孵育30分鐘。

4、洗板：倒出孔中的液體，將微孔架倒置在干凈吸水紙上拍打，以保證*除去孔中的液體。每孔加滿稀釋后的洗滌工作液，靜置20秒鐘，甩去液體，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次。

5、加標準品/樣品：加入50μL標準品或處理好的樣品到各自的微孔中，標準品和樣品做兩個平行實驗，然后加入50μL酶標記物到微孔，小心地充分混合，37℃恒溫箱孵育30分鐘。

6、重復3的操作。

7、顯色：每孔先加入底物液A 50μL，再加入底物液B 50μL，37℃避光孵育15min（如果顯色過淺，可適當延長孵育時間，反之亦然）。

8、測定：每孔加入終止液50μL，設定酶標儀于450nm處，測定每孔OD值。

九、結果判定

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準（0標準）的吸光度值，再乘以*，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ppb標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以克侖特羅標準品濃度（ppb）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中克侖特羅的實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（索?。?/span>

十、注意事項

1、嚴格按照說明書操作時間，每加一種試劑前需要將其搖勻，各操作步驟緊湊進行。

2、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

3、在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

4、試劑變質的跡象

底物有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

6、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色15min即可。若顏色較淺，可延長反應時間到25min（或更長），但不得超過30min。反之，則減短反應時間。

7、反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

十一、貯存條件及有效期

貯存條件：2-8℃、干燥避光防潮。

有效期：在正確貯存條件下，有效期為12個月。