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分子生物學實驗基礎

閱讀:190發布時間:2017-8-17

分子生物學是在生物化學基礎上發展起來的,以研究核酸和蛋白質結構、功能等生命本質的學科,在核酸、蛋白質分子水平研究發病、診斷、治療和預后的機制。其中基因工程(基因技術,基因重組)是目前分子生物學研究熱點,這些技術可以改造或擴增基因和基因產物,使微量的研究對象達到分析水平,是研究基因調控和表達的方法,也是分子水平研究疾病發生機制、基因診斷和基因治療的方法。轉化(transformation)、轉染、轉導、轉位等是自然界基因重組存在的方式,也是人工基因重組常采用的手段。基因重組的目的之一是基因克隆(gene clone),基因克隆可理解為以一分子基因為模板擴增得到的與模板分子結構*相同的基因。使需要分析研究的微量、混雜的目的基因易于純化,得以增量,便于分析。 
 
外來基因引起細胞生物性狀改變的過程叫轉化(transformation),以噬菌體把外源基因導入細菌的過程叫轉染(transfection)。利用載體(噬菌體或病毒)把遺傳物質從一種宿主傳給另一種宿主的過程叫轉導(transduction)。一個或一組基因從一處轉移到基因組另一處的過程叫轉位(transposition),這些游動的基因叫轉位子。 
 
  
一、基因工程的常用工具 
 
(一)載體 
 
載體(Vector)是把外源DNA(目的基因)導入宿主細胞,使之傳代、擴增、表達的工具。載體有質粒(plasmid)、噬菌體、單鏈絲狀噬菌體和粘性末端質粒(粘粒)、病毒等。載體具有能自我復制;有可選擇的,便于篩選、鑒定的遺傳標記;有供外源DNA插入的位點;本身體積小等特征。 
 
質粒存在于多種細菌,是染色體(核)以外的獨立遺傳因子,由雙鏈環狀DNA組成,幾乎*裸露,很少有蛋白質結合。質粒有嚴緊型和松弛型之分。嚴緊型由DNA多聚酶Ⅲ復制,一個細胞可復制1-5個質粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ復制,一個細胞可復制30-50個質粒,如果用*可阻止蛋白質合成,使質粒有效利用原料,復制更多的質粒。質粒經過改造品種繁多,常用的有pBR322、pUC系列等。這些質粒都含有多個基本基因,如復制起動區(復制原點Ori),便于復制擴增;抗抗生素標記(抗氨芐*Apr、抗四環素Tcr等)或大腸埃希菌部分乳糖操縱子(E.coli LacZ)等,便于基因重組體的篩選;基因發動子(乳糖操縱子Lac、*操縱子Trp等)和轉錄終止序列,便于插入的外源基因轉錄、翻譯表達。質粒上還有許多限制性內切酶的切點,即基因插入位點,又叫基因重組位點,基因克隆位點。 
 
常用噬菌體載體有單鏈噬菌體M13系統;雙鏈噬菌體系統。噬菌體應和相應的宿主細胞配合使用。以上載體各有特點,便于選擇,靈活應用。


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