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上海永葉生物科技有限公司
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閱讀:698發布時間:2012-5-26
IL-4能阻斷IFN對L929細胞的保護作用,其拮抗程度與IL-4濃度相關,據此可通過對L929細胞保護作用的抑制率來反映樣本中IL-4的含量。
(1)取生長良好的L929細胞傾去培養液,加入0.25%*消化后,充分洗滌細胞,調整細胞濃度至1×105—3×105/mL,每孔加1001~L,37℃,5%C02溫箱中培養24h。
(2)采用9—10日齡雞胚,制備成纖維細胞單層培養,接種適量VSV病毒。當細胞病變達+++—++++時,收獲病毒,并進行病毒TCID50測定。
(3)將待檢上清和rlL-4分別與4U/mL IFN混合,在L929細胞培養孑L內加100/zL。37~C,5%c02溫箱中孵育24h。
(4)VSV攻擊:每孔加100uL病毒懸液,含200TCIDso;置37~C,5%C02溫箱培養48h,待病毒對照孔病變達+++—++++,細胞對照正常時,測定結果。
(5)將培養液全部倒出,用Hanks液洗3次;每孔加入100bL0.5%結晶紫染色液,染10—20rain棄去,Hanks液洗3次,加入95%酒精。放小型振蕩器上振搖15min左右,待細胞內染料*溶解。用分光光度計540nm波長測OD值,以準確客觀地反映細胞存活數量。
(6)注意事項:①L929細胞在營養條件不良時,可呈圓形漂浮狀,此時更換培養液可使其恢復為梭形貼壁細胞;②L929細胞要均勻分散于培養板孔中,否則可能造成某個部位細胞過密,另一部分過稀,將影響細胞單層的形成。
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