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技術文章

IL—10的檢測

閱讀:621發布時間:2012-5-5

IL-10由輔助性T細胞亞群THl和TH2,單核細胞、巨噬細胞、B細胞和角質細胞(keratinocyte)產生。其生物活性廣泛,可選擇性地抑制單核一巨噬細胞的某些功能,對T細胞、B細胞等的功能亦有明顯影響。現已獲得重組的鼠和人IL-10及其特異性McAb。B細胞等在正常狀態下可分泌一定量的IL-10,用LIS刺激可使其產量明顯增加,誘生高峰在孵育18h后。
(一)ELISA試驗
用IL-10McAb包被反應板,以*結合的第二抗體進行夾心法ELISA檢測IL-10活性或含量。
(二)生物活性測定法
可根據IL-10對抗原刺激THl細胞產生IFN-7的抑制作用測定其活性。若不能維持培養Tul細胞,可用PHA刺激的脾細胞代替。
1.向96孔培養板每孔加50/zLRPMI-1640和50ul待測標本,并設置IL-10標準品(40ne/mL)對照,每一標本及對照組均設置3個復孔。
2.混勻后,自H排每孔取50gL加入G排,混勻后,自G排每孔取501~L加入F排,如此類推直至B排,A排作為陰性對照。
3.以2 500rad~C。照射鼠脾細胞,洗滌并計數,用RPMI-1640調整細胞濃度至2X107/mL。
4.用RPMI-1640洗THl細胞,用含抗原的培養液(終濃度為0.04%雞紅細胞)調整細胞濃度至2X106/mL。
5.將步驟(3)和(4)所得脾細胞和T細胞等體積混合,如可能存在IL-2、IL-4或TGF-b時,加相應MeAb對照(抗IL-4 5弘g/mL;抗IL-2 2ng/mL;抗TGF-p10ng/mL)。
6.每孔加501aLT細胞、脾細胞、抗原混合液,37~C C02溫箱中培養24h。
7.從每孔中取上清50/uL(注意勿吸出細胞),測上清的IFN-r,繪制標準曲線,并計算IL-10濃度。


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