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上海永葉生物科技有限公司
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閱讀:1897發布時間:2011-9-14
純化過程在DNA全自動合成儀上是自動進行的,但也有以下幾種手工方法可以選擇。
1.NAP柱純化
由Pharmacia公司生產,主要成分為SephadexG-25,經特殊處理后裝成不同體積的小柱,常用的有NAP-10。含寡核苷酸片段的氨水溶液,調整體積為lml加樣于NAP-10柱上(使用前以15ml雙蒸水平衡柱子)以lml雙蒸水洗脫,收集洗脫下的液體,即為純化的寡核苷酸,NAP-10柱可以純化長度在10mer以上的寡核苷酸,產率在90%以上。經NAP-10柱純化后樣品中鹽的含量少于3%,*可以滿足實驗的需要。
2.丙烯酰胺凝膠電泳純化
從合成柱上洗脫的寡核苷酸片段,冰凍、干燥、去氨水,溶于適量水中后,點樣于15%~20%丙烯酰胺凝膠制備膠上,按10v/C1TI條件電泳,過夜。電泳完畢后,取下凝膠于EB染色后觀察,或直接將含寡核苷酸片段的凝膠置于硅膠熒光板上(CMC板)紫外線燈下,根據分子質量的標準切下所需的區段(呈黑色),將膠塊置于少量緩沖液(10mmol/LTris—HCl,pH8.0,lmmol/LEDTA,300mmol/LNaCl)中,搗碎膠塊,25~42~C浸泡過夜(4~24h),或將膠塊置于有少量緩沖液的透析袋中,通電情況下,寡核苷酸片段即進入透析袋中。洗脫的寡苷酸核片段以乙醇沉淀、洗滌,真空抽干后即可應用。
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