C3是補(bǔ)體二條激活途徑的關(guān)鍵分子，C3活化后裂解為C3a、C3b兩個(gè)片段，C3a很快被血清羧肽酶N裂解為C3adesarg，C3b被H、I因子滅活為C3bi，經(jīng)蛋白酶水解為C3c、C3d、C3dg等，檢測(cè)這些裂解產(chǎn)物即可反映C3的活化程度。
C3a的定量檢測(cè)采用競(jìng)爭(zhēng)性抑制放射免疫法。其原理為用“I標(biāo)記C3（“I-C3）與待測(cè)樣本、兔抗人C3a多克隆抗體一起孵育，待測(cè)樣本中的C3a（未標(biāo)記抗原）能競(jìng)爭(zhēng)性地與抗C3a結(jié)合，使C3a復(fù)合物（B）增多，而“I-C3游離出來(lái)（F），根據(jù)B％來(lái)判斷待測(cè)樣本中C3a的含量。
1．樣本的采集 EDTA抗凝血漿（EDTA終濃度為lOmm01），2000r?min離心10rain，等量分裝，置—70~C保存待檢。
2．標(biāo)記抗原的制備 用氯胺T法以125I標(biāo)記C3純品，制成125I-C3。
3．標(biāo)記抗原（125I-C3）、兔抗人C3a復(fù)合物的制備 取1sCNBr活化的Sepharose4B偶聯(lián)IOOuL不同稀釋度兔抗人C3a血清，Sepharose 4B用含有l(wèi)Ommol EDTA、0．3％（W／V）Tween 20pH7．4PBS（PBS-ET）浸泡，加入PBS-ET稀釋的125I-C3 （大約1 500cpm）50／uL，室溫16h，反應(yīng)在2mL聚苯乙烯試管中進(jìn)行。次日用生理鹽水洗4次，然后測(cè)定Sepharose4B放射活性B％。125I-C3與抗C3a-Sepharose4B的zui大結(jié)合率為90％。
4．待測(cè)樣本中C3a的檢測(cè) 將EDTA抗凝血漿或血清與等體積含22％（W／V）PEG的0．1mol／L，pH8．3硼酸鹽緩沖液混合，0cC孵育60rain，2 000r／min離心30min，取上清。選擇上述125I-C3抗C3a復(fù)合物50％結(jié)合率所需的抗C3a血清稀釋液，取0．5mL加入50／uLPEG沉淀的上清和50／uL125I-C3，室溫16h，用生理鹽水洗滌4次，計(jì)算Sepharose4B的放射活性（B％）。
5．標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將新鮮血清于37℃放置7d（normal senlinaged，NSA），血清中含0．02％（W／V）NaN3。以NSA作為C3a放射免疫分析法（RIA）的標(biāo)準(zhǔn)品。NSA中C3a的濃度為60ug／mL，可將NSA作不同濃度的稀釋，50／uL1：10 000稀釋的NSA足夠抑制“I-C3與抗C3a-Sepharose4B的結(jié)合。然后以B％為縱坐標(biāo)，不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。本法zui低檢測(cè)限為0．66nmol／L，正常值為1．55±0．87nmol／L（X±1SD）。
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