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染色標(biāo)本的復(fù)染、保存及封片介質(zhì)的制備

閱讀:2930發(fā)布時(shí)間:2011-3-15

一、免疫熒光組織化學(xué)的細(xì)胞核復(fù)染
免疫熒光染色后,為了襯托出細(xì)胞和組織的固有形態(tài)結(jié)構(gòu),增加特異性熒光的可見性,縮短照相時(shí)間,根據(jù)特異性結(jié)合熒光染料發(fā)射光的顏色,選擇不同顏色的復(fù)染熒光染料。wd3

(一)藍(lán)色熒光復(fù)染劑
DAPI(4,6—二氨基—2—苯基吲哚)是經(jīng)典的細(xì)胞核和染色體復(fù)染劑。DAPI可選擇性與dsDNA結(jié)合,細(xì)胞質(zhì)幾乎沒有背景染色,它的相對低水平的熒光發(fā)射不能被來自標(biāo)記二抗上的綠色或紅色熒光或FISH探針淹沒。DAPI對活細(xì)胞有半通透性,可在固定細(xì)胞或組織切片中使用。用SlowFade和SlowFade光抗衰減劑預(yù)處理的DAPI可同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞核染色和抗衰變保護(hù)。

Hoechst 33342染料已經(jīng)廣泛用于活細(xì)胞細(xì)胞核染色,已有用于免疫熒光組化和FISH后的襯染,其工作濃度為0.2ug/m1(Sigma公司產(chǎn)品)。藍(lán)色熒光BOBO—1核酸染料發(fā)射的熒光信號比DAPI更明亮。BOBO—1已經(jīng)作為有效的復(fù)染劑進(jìn)行果蠅染色體染色,并可與Cy3熒光或熒光黃標(biāo)記二抗結(jié)合。

(二)綠色熒光復(fù)染劑
某些花青染料是綠色熒光核復(fù)染劑,例如YO-PRO—1染料和SyTOXGreen染料。花青染料不僅可作為免疫熒光組化染色的復(fù)染劑,還可作為細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期研究的熒光染料,SYTOXGkeen染料已經(jīng)用來追蹤凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)改變,是VY-brant凋亡分析試劑盒的一種成分。

(三)黃色熒光復(fù)染劑
Hoechsts769121和Trueblue染料可作為免疫熒光組化黃色熒光的復(fù)染劑,染成藍(lán)色。

(四)橙色和紅色熒光復(fù)染劑
碘化丙錠(propidiumiodide,P1)是細(xì)胞核和染色體的紅色熒光復(fù)染劑。PI是進(jìn)行綠色熒光標(biāo)記(例如AlexaFluor 488、俄勒岡綠、BodipyFL、熒光黃等熒光素)的復(fù)染劑。其次是BOBO-3和SYTOX橙。

二、染色標(biāo)本的保存
標(biāo)本染色后立刻在熒光顯微鏡下觀察,染色當(dāng)天熒光zui強(qiáng)。但由于種種原因,標(biāo)本染色后不能及時(shí)觀察,需保存。用緩沖甘油封片的標(biāo)本,保存在4~C中,過夜后特異性熒光強(qiáng)度減弱約25%,保存一周后大約減弱60%,如用*(ELvan01)封片的標(biāo)本,保存幾周后特異性熒光的強(qiáng)度才有所減弱。羅丹明熒光素在*中溶解,因此,用羅丹明標(biāo)記的抗體不能用*封片介質(zhì)封片,但可用熒光信號增強(qiáng)封片劑封片,此封片介質(zhì)不但能保持熒光信號不減弱,而且有增強(qiáng)效果。

三、封片介質(zhì)的制備
1.緩沖甘油封片介質(zhì)(常用)
0.5mol/l碳酸鹽緩沖液(pH8.5),lOml;無熒光甘油(AR級),90ml。
混合后在攪拌器上充分混勻。
2.*—緩沖甘油混合介質(zhì)
0.5mol/L碳酸鹽緩沖液(pH8.5),40ml;1%*,lOml;分析純甘油,lOml。三液混合后,不斷攪拌6h,72000g離心1h,吸取上清4℃保存?zhèn)溆谩?br />3.熒光信號增強(qiáng)封片劑
*40~88,4.8g;分析純甘油,12ml;蒸餾水,12ml;0.2mol/L Tris鹽(pH8.5),24ml;l,4—重氮雙環(huán)—[2,2,2]—辛烷,L 25g(終濃度約2.5%)。
配制方法:取4.8g*40~88和12ml甘油,加入到12ml蒸餾水和0.2mol/L
Tris—HCl(pH8.5)的緩沖液中加熱到50℃,并攪拌10min,待*溶解后5000g離心15min,取上清到小燒杯中,邊攪拌邊加入1.25g 1,4—重氮雙環(huán)—[2,2,2]—辛烷(約2.5%),溶解后,分裝保存于一20℃中。
 


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