一、免疫熒光組織化學(xué)的細(xì)胞核復(fù)染
免疫熒光染色后，為了襯托出細(xì)胞和組織的固有形態(tài)結(jié)構(gòu)，增加特異性熒光的可見性，縮短照相時(shí)間，根據(jù)特異性結(jié)合熒光染料發(fā)射光的顏色，選擇不同顏色的復(fù)染熒光染料。wd3
（一）藍(lán)色熒光復(fù)染劑
DAPI（4，6—二氨基—2—苯基吲哚）是經(jīng)典的細(xì)胞核和染色體復(fù)染劑。DAPI可選擇性與dsDNA結(jié)合，細(xì)胞質(zhì)幾乎沒有背景染色，它的相對低水平的熒光發(fā)射不能被來自標(biāo)記二抗上的綠色或紅色熒光或FISH探針淹沒。DAPI對活細(xì)胞有半通透性，可在固定細(xì)胞或組織切片中使用。用SlowFade和SlowFade光抗衰減劑預(yù)處理的DAPI可同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞核染色和抗衰變保護(hù)。
Hoechst 33342染料已經(jīng)廣泛用于活細(xì)胞細(xì)胞核染色，已有用于免疫熒光組化和FISH后的襯染，其工作濃度為0．2ug／m1（Sigma公司產(chǎn)品）。藍(lán)色熒光BOBO—1核酸染料發(fā)射的熒光信號比DAPI更明亮。BOBO—1已經(jīng)作為有效的復(fù)染劑進(jìn)行果蠅染色體染色，并可與Cy3熒光或熒光黃標(biāo)記二抗結(jié)合。
（二）綠色熒光復(fù)染劑
某些花青染料是綠色熒光核復(fù)染劑，例如YO-PRO—1染料和SyTOXGreen染料。花青染料不僅可作為免疫熒光組化染色的復(fù)染劑，還可作為細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期研究的熒光染料，SYTOXGkeen染料已經(jīng)用來追蹤凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)改變，是VY-brant凋亡分析試劑盒的一種成分。
（三）黃色熒光復(fù)染劑
Hoechsts769121和Trueblue染料可作為免疫熒光組化黃色熒光的復(fù)染劑，染成藍(lán)色。
（四）橙色和紅色熒光復(fù)染劑
碘化丙錠（propidiumiodide，P1）是細(xì)胞核和染色體的紅色熒光復(fù)染劑。PI是進(jìn)行綠色熒光標(biāo)記（例如AlexaFluor 488、俄勒岡綠、BodipyFL、熒光黃等熒光素）的復(fù)染劑。其次是BOBO-3和SYTOX橙。
二、染色標(biāo)本的保存
標(biāo)本染色后立刻在熒光顯微鏡下觀察，染色當(dāng)天熒光zui強(qiáng)。但由于種種原因，標(biāo)本染色后不能及時(shí)觀察，需保存。用緩沖甘油封片的標(biāo)本，保存在4~C中，過夜后特異性熒光強(qiáng)度減弱約25％，保存一周后大約減弱60％，如用*（ELvan01）封片的標(biāo)本，保存幾周后特異性熒光的強(qiáng)度才有所減弱。羅丹明熒光素在*中溶解，因此，用羅丹明標(biāo)記的抗體不能用*封片介質(zhì)封片，但可用熒光信號增強(qiáng)封片劑封片，此封片介質(zhì)不但能保持熒光信號不減弱，而且有增強(qiáng)效果。
三、封片介質(zhì)的制備
1．緩沖甘油封片介質(zhì)（常用）
0．5mol／l碳酸鹽緩沖液（pH8．5），lOml；無熒光甘油（AR級），90ml。
混合后在攪拌器上充分混勻。
2．*—緩沖甘油混合介質(zhì)
0．5mol／L碳酸鹽緩沖液（pH8．5），40ml；1％*，lOml；分析純甘油，lOml。三液混合后，不斷攪拌6h，72000g離心1h，吸取上清4℃保存?zhèn)溆谩?br />3．熒光信號增強(qiáng)封片劑
*40～88，4．8g；分析純甘油，12ml；蒸餾水，12ml；0．2mol／L Tris鹽（pH8．5），24ml；l，4—重氮雙環(huán)—[2，2，2]—辛烷，L 25g（終濃度約2．5％）。
配制方法：取4．8g*40～88和12ml甘油，加入到12ml蒸餾水和0．2mol／L
Tris—HCl（pH8．5）的緩沖液中加熱到50℃，并攪拌10min，待*溶解后5000g離心15min，取上清到小燒杯中，邊攪拌邊加入1．25g 1，4—重氮雙環(huán)—[2，2，2]—辛烷（約2．5％），溶解后，分裝保存于一20℃中。
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