一、免疫熒光組織化學的細胞核復染
免疫熒光染色后，為了襯托出細胞和組織的固有形態結構，增加特異性熒光的可見性，縮短照相時間，根據特異性結合熒光染料發射光的顏色，選擇不同顏色的復染熒光染料。wd3
（一）藍色熒光復染劑
DAPI（4，6—二氨基—2—苯基吲哚）是經典的細胞核和染色體復染劑。DAPI可選擇性與dsDNA結合，細胞質幾乎沒有背景染色，它的相對低水平的熒光發射不能被來自標記二抗上的綠色或紅色熒光或FISH探針淹沒。DAPI對活細胞有半通透性，可在固定細胞或組織切片中使用。用SlowFade和SlowFade光抗衰減劑預處理的DAPI可同時進行細胞核染色和抗衰變保護。
Hoechst 33342染料已經廣泛用于活細胞細胞核染色，已有用于免疫熒光組化和FISH后的襯染，其工作濃度為0．2ug／m1（Sigma公司產品）。藍色熒光BOBO—1核酸染料發射的熒光信號比DAPI更明亮。BOBO—1已經作為有效的復染劑進行果蠅染色體染色，并可與Cy3熒光或熒光黃標記二抗結合。
（二）綠色熒光復染劑
某些花青染料是綠色熒光核復染劑，例如YO-PRO—1染料和SyTOXGreen染料。花青染料不僅可作為免疫熒光組化染色的復染劑，還可作為細胞凋亡、細胞周期研究的熒光染料，SYTOXGkeen染料已經用來追蹤凋亡細胞的細胞核形態改變，是VY-brant凋亡分析試劑盒的一種成分。
（三）黃色熒光復染劑
Hoechsts769121和Trueblue染料可作為免疫熒光組化黃色熒光的復染劑，染成藍色。
（四）橙色和紅色熒光復染劑
碘化丙錠（propidiumiodide，P1）是細胞核和染色體的紅色熒光復染劑。PI是進行綠色熒光標記（例如AlexaFluor 488、俄勒岡綠、BodipyFL、熒光黃等熒光素）的復染劑。其次是BOBO-3和SYTOX橙。
二、染色標本的保存
標本染色后立刻在熒光顯微鏡下觀察，染色當天熒光zui強。但由于種種原因，標本染色后不能及時觀察，需保存。用緩沖甘油封片的標本，保存在4~C中，過夜后特異性熒光強度減弱約25％，保存一周后大約減弱60％，如用*（ELvan01）封片的標本，保存幾周后特異性熒光的強度才有所減弱。羅丹明熒光素在*中溶解，因此，用羅丹明標記的抗體不能用*封片介質封片，但可用熒光信號增強封片劑封片，此封片介質不但能保持熒光信號不減弱，而且有增強效果。
三、封片介質的制備
1．緩沖甘油封片介質（常用）
0．5mol／l碳酸鹽緩沖液（pH8．5），lOml；無熒光甘油（AR級），90ml。
混合后在攪拌器上充分混勻。
2．*—緩沖甘油混合介質
0．5mol／L碳酸鹽緩沖液（pH8．5），40ml；1％*，lOml；分析純甘油，lOml。三液混合后，不斷攪拌6h，72000g離心1h，吸取上清4℃保存備用。
3．熒光信號增強封片劑
*40～88，4．8g；分析純甘油，12ml；蒸餾水，12ml；0．2mol／L Tris鹽（pH8．5），24ml；l，4—重氮雙環—[2，2，2]—辛烷，L 25g（終濃度約2．5％）。
配制方法：取4．8g*40～88和12ml甘油，加入到12ml蒸餾水和0．2mol／L
Tris—HCl（pH8．5）的緩沖液中加熱到50℃，并攪拌10min，待*溶解后5000g離心15min，取上清到小燒杯中，邊攪拌邊加入1．25g 1，4—重氮雙環—[2，2，2]—辛烷（約2．5％），溶解后，分裝保存于一20℃中。
