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上海永葉生物科技有限公司


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蛋白質轉印法

閱讀:1701發布時間:2010-12-18

蛋白質經SDS-PAGE后,膠片浸入轉印緩沖液,蛋白質可被轉印到硝化纖維紙(nitrocellulose) 上,先經?素洗去SDS,并使蛋白質回?原態抗原性,可使用抗體進?免疫染色 (Towbin et al, 1979)。
儀器用具:電泳轉印槽 (Hoefer Transphor TE 52):轉印槽 (可容納4 個轉印三明治)轉印三明治 (轉印夾、方形海綿墊2 片)轉印紙:早期使用硝化纖維紙,現在多用尼龍材質者Immobilon P (Millipore IPUH 000 10, 0.45 μm, PVDF 材質)濾紙 (Whatman #1, 3MM) 兩張,裁成比轉印紙稍大者。供電器 (可供400~500 mA者)方形培養皿 (轉印紙清洗用)旋轉搖蕩器 (rotary shaker)

藥品試劑:
轉印緩沖液 (Blotting buffer):10×溶液
Tris (Tris base, 25 mM×10) 60.6 gm
甘胺酸 (0.192 M×10) 288 gm加水1,500 mL 溶的,pH 以HCl 調到8.3,加水至 2,000 mL 使用時取500 mL 倒入一5 L 桶中,加500 mL 甲醇后,加水到5 L,均勻攪拌的。 如此配成者,含10%甲醇;?是轉印勝或是蛋白質的分子?太小,可提高到20%。
甲醇 (用?潤濕尼龍材質的轉印紙)
PBST 洗液:PBST 為pH 7.0 的PBS (phosphate buffered saline) 緩沖液,另加有0.05%Tween-20,用?清洗轉印紙,以去除非專一性的蛋白質吸附。
?素洗液 (6M Urea-PBST) :?素180 gm 溶在300 mL PBST 中,加溫攪拌溶解,再加PBST 至500 mL。

方法步驟:
◆ 全程請戴手套操作,以免污染轉印紙!
1) 電泳后SDS-PAGE 膠片浸在轉印緩沖液中,洗2~3 次,每次10 min。
2) 取出轉印槽,先小心放一攪拌子在底部,再倒一半轉印緩沖液。
◆ 攪拌子千萬?能丟到轉印槽內,會打破轉印槽底部的陶瓷散熱片。
3) 取轉印紙切成約如膠片大小,先在方形培養皿中以少許甲醇浸濕數秒鐘,再置入轉印槽中的緩沖液10 min 后使用。 另取兩張濾紙,以及兩片方形海綿墊,?放在轉印槽的緩沖液中備用。
4) 取出轉印夾打開平放,先墊一張方形海棉墊,鋪上一張濕濾紙,小心迭上已潤濕的轉印紙,其間勿陷入氣泡;轉印紙再滴上數滴緩沖液后,小心平鋪膠片上去,加蓋一層濾紙,及另一張海綿,也??可陷入氣泡,即可把整個轉印三明治卡夾裝好。
◆ 膠片迭到轉印紙時,一次成功,?要重作,否則蛋白質色帶可能會印上去,zui后產生重迭影像。
5) 將轉印三明治置入已經放有一半轉印緩沖液的轉印槽中,注意有轉印紙的那一面向正極 (紅色),膠片那面向負極 (黑色)。
6) 當三明治?放入轉印槽后,以轉印緩沖液蓋滿所有的三明治,小心動一動卡夾,除去附在卡夾內外的氣泡,蓋上蓋子,放到一攪拌器上,打開攪拌器開始攪拌,同時接好電源,裝置完成后放置10 min。
7) 以400 mA 開始轉印,溫?會漸漸上升,轉印1.5 h 后中止轉印,取出轉印三明治,打開后依次取出轉印紙及膠片。
◆ 上述轉印條件會使溫?上升至70~90℃,?有?卻系統,可把溫?控制設在5℃;轉印槽內應該加以攪拌,以?使整個溫?分布均勻。
8) 轉印后的膠片可以繼續進?CBR 染色,看有無蛋白質殘?。 ?電泳時加有藍色標準蛋白質marker (SeeBlue),則可在轉印紙上看到藍色的色帶,確定轉印成功,并可評估轉印效?。
9) 轉印紙浸在約15 mL ?素洗液中浸洗過夜,期間換三次?素洗液,并且要溫和搖蕩的。
10) ??做免疫染色,則轉印后?用?素洗液清洗,以清水沖過后改用amido black (l %溶于10%甲酸) 染色1 h,再以10%甲酸脫色,沖水后晾干即可,但其?敏?較低。
 


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