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上海永葉生物科技有限公司
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閱讀:3362發(fā)布時間:2017-9-19
重組DNA轉(zhuǎn)化受體細胞后,須在不同水平上進行篩選,以區(qū)別轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子以及鑒定所需的特異性重組子。在轉(zhuǎn)化過程中,并非每個受體細胞都被轉(zhuǎn)化;即使獲得轉(zhuǎn)化細胞,也并非都含有目的基因,所以需采用有效方法進行篩選。篩選的方法包括根據(jù)遺傳表型篩選、限制性內(nèi)切酶分析篩選、核酸探針篩選、PCR篩選等。本實驗采用遺傳表型篩選中的抗生素平板篩選或α互補篩選的方法。
一、抗生素平板篩選
【實驗原理】
目標基因是Kan的抗性基因,而載體含Amp 的抗性基因,因此在含有Amp 和Kan的培養(yǎng)基中生長的菌落即為陽性菌落。
【操作步驟】
1.制備含有Amp 和 Kan 的LB瓊脂培養(yǎng)板
2.將100μl 轉(zhuǎn)化菌液用無菌涂布器均勻涂布于含有Amp 和Kan培養(yǎng)板上,37℃培養(yǎng)12-16h 。
3.在含有Amp和Kan培養(yǎng)板上能生長的菌落即為陽性重組質(zhì)粒。并將其接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基2ml中培養(yǎng)8-16h。
4.小量制備質(zhì)粒,限制性酶切分析進一步鑒定。
二、α互補篩選
【實驗原理】
適用于含有半乳糖苷酶基因(LacZ)的載體,如 pUC系列等,其原理是:載體含有LacZ的調(diào)控序列和N端146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點。當這種載體進入可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞后(質(zhì)粒和宿主細胞編碼的片段各自都沒有酶活性),它們可以融為一體,形成具有酶學活性的蛋白質(zhì),這種現(xiàn)象叫α互補。由α互補而產(chǎn)生的 Lac+ 細菌在呈色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷(X-gal)和誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)存在下形成藍色菌落。當外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后,導致產(chǎn)生無α互補能力的氨基端片段。因此,帶有重組質(zhì)粒的細菌形成白色菌落。通過呈色反應(yīng)即可初步識別可能帶有重組質(zhì)粒的菌落。通過小量制備質(zhì)粒DNA進行限制酶切分析,即可確定這些質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。
【試劑】
1.X-gal(20mg/m l):將20mg X-gal溶于l ml二甲基甲酰胺中,-20℃避光保存。
2.IPTG(200mg/ml):將1g IPTG溶于4 ml去離子雙蒸水中,定容至5 ml,用0.22μm過濾器除菌,-20℃保存?zhèn)溆谩?span style="font-family:arial; font-size:14px">
【操作步驟】
1.制備含相應(yīng)抗生素的瓊脂平板。
2.于平板表面加 X-gal 40μl 和IPTG 4μl,并用無菌玻璃涂布器將試劑均勻涂布于整個平板表面。37℃靜置l h。
3.
將100μl 轉(zhuǎn)化的菌液涂布于平板表面,置37℃培養(yǎng)箱20 min后,倒置平板繼續(xù)培養(yǎng)12~16h。
4.中止培養(yǎng)后,將平板靜置4℃ 4h,使藍色充分顯現(xiàn),平皿上顯示藍色和白色兩種菌落。
5.挑取白色菌落置2 ml LB(含相應(yīng)抗生素)液體培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)8~12h。
6.提取質(zhì)粒,以限制性酶切分析進一步鑒定。
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