前言簡介
白介素1一類非常重要的具備生物活性單核細胞衍生蛋白,它參與了多種炎癥與免疫反應. 有2種不同的白介素1已經(jīng)被鑒別,分別為白介素1α和白介素1β,它們有相似的分子量,生物功能和相同的受體.白介素1蛋白是由巨噬細胞,單核細胞和各種類型的細胞(如成熟T細胞,纖維母細胞,上皮或內(nèi)皮細胞,中性粒細胞和星形膠質(zhì)細胞)分泌的.它們的生物學特性包括發(fā)熱性,骨吸收,暴露抗原和刺激B和T淋巴細胞增殖.
原理
此試劑盒運用了兩種特異性抗體,洗板后加入TMB底物液顯色,顯色的強度與大鼠白介素1β的量成正比.
檢測范圍
11.72 ~ 750 pg/mL
預期用途
■此IBL試劑盒能用于大鼠血清,EDTA血漿,細胞上清中白介素1β的定量檢測
試劑盒成分
1 包被板: 抗大鼠白介素1β兔子IgG,親合純化 96T
2 酶標記抗體:
(30倍濃縮)HRP標記抗大鼠白介素1β兔子IgG,親合純化 0.4mL x 1
3 標準品: 重組大鼠白介素1β 0.5mL x 2
4 EIA緩沖液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 30mL x 1
5 標記抗體稀釋液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 12mL x 1
6 顯色劑: TMB底物液 15mL x 1
7 終止液: 1N硫酸 12mL x 1
8 濃縮洗滌液:
(40倍濃縮) 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 50mL x 1
操作說明
1實驗所需器材(但試劑盒沒有提供)
酶標儀(450nm) 微移液管及其吸嘴
量筒及燒杯 蒸餾水
冰箱(4°C) 坐標紙(log/log)
吸水紙 試管(用于標準品稀釋)
溫育箱(37°C ± 1°C)
洗瓶(用于洗板)
一次性試劑管(用于濃縮酶標記抗體和顯色劑)
2準備
- 洗滌液的準備
試劑盒的洗滌液是一種40倍濃縮液,用1950 mL蒸餾水稀釋50 mL的濃縮洗滌液,制成2000mL即用稀釋洗滌液. 置于冰箱內(nèi)可保存2周.
- 酶標記抗體的準備
試劑盒中的標記抗體是一種30倍濃縮物,根據(jù)所需量,用標記抗體稀釋液稀釋30倍.
示例:
如果你用一條板(8孔),就需800 μL.的標記抗體.就用870 μL的標記抗體稀釋液稀釋30 μL抗體濃縮液,充分混勻.并每孔各加100 μL
濃縮酶標記抗體需稀釋后才能用于實驗
剩余的稀釋標記抗體液需密封瓶裝,存于4°C
- 標準品的準備
加0.5 mL的蒸餾水到瓶裝標準品,制成濃度為1500 pg/mL大鼠白介素1β標準品液
- 標準品的稀釋
準備8支試管,并每支各加230 μL EIA緩沖液.稀釋成如下濃度,步驟如下圖所示:
試管1 750 pg/mL
試管2 375 pg/mL
試管3 187.5 pg/ mL
試管4 93.75 pg/mL
試管5 46.88 pg/mL
試管6 23.44 pg/mL
試管7 11.72pg/mL
試管8 0 pg/mL(樣品空白對照)
吸取230ul的標準品液于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管混勻，如下圖所示,按此規(guī)律稀釋，第8號管為0 pg/mL作為樣品空白對照
- 樣品稀釋
樣品如需稀釋時,必須用EIA緩沖液進行稀釋
如果樣品中大鼠白介素1β的濃度范圍一無所知的話,預先準備幾個不同稀釋濃度的樣品液來確定*的檢測濃度.
3實驗步驟
使用前，將所有試劑應平衡至室溫，大約30min，充分混勻，確保試劑質(zhì)量無改變，標準曲線和樣品檢測必須同時進行.
| 試劑 | 待檢測樣品 | 標準品 | 樣品空白 | 試劑空白 |
| 檢測樣品100ul | 稀釋標準品（1-7管）100ul | EIA緩沖液（第8管）100ul | EIA緩沖液100ul |
| 蓋板，于4°C下溫育過夜 |
| 洗板7次 |
| 酶標抗體 | 100ul | 100ul | 100ul | - |
| 蓋板，于4°C下溫育30min |
| 洗板9次 |
| 顯色劑 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
| 室溫避光溫育30min |
| 終止液 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
| 加終止液后,30min內(nèi)于450nm處讀取OD值 |
1）設試劑空白對照，并于相應的微孔中加入100ul EIA緩沖液
2） 確定好樣品空白對照孔，檢測樣品孔和標準品孔，分別將100ul樣品對照品(8號管)、檢測樣品和稀釋好的標準品(1-7號管)加入到相應的微孔中。
3）蓋板，4°C下溫育過夜
4）用洗滌瓶劇烈洗板,再加入稀釋洗滌液,靜置15-30秒,再*倒去孔內(nèi)反應液
重復洗板7次.
zui后在吸水紙上拍干,去除殘留液滴
如用自動洗板機洗板,先自動洗4次,再按上述用洗瓶手工洗3次
5）除試劑空白對照孔外,其余每孔各加100ul酶標抗體
6）蓋板，4°C下溫育30min
7）按照上述步驟4）洗板9次
8） 用一次性試管取所需量的顯色劑，各加100ul顯色劑于微孔中.為了避免污染，勿將剩余試劑在倒回試劑瓶中
9）室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會變成藍色
10）每孔各加100ul終止液，溶液顏色會變成黃色
11）擦去微孔板底部的污跡或水滴，確保微孔內(nèi)溶液無氣泡產(chǎn)生.加入終止液后30min內(nèi)于酶標儀450nm處讀取結(jié)果
特別注意
- 收集樣品后盡快檢測. 如需保存, 凍存樣品,但要避免反復凍融.檢測前,將樣品解凍至室溫.
- 如樣品需稀釋,用EIA緩沖液稀釋
- 建議樣品,標準品做雙份檢測
- 保持樣品處于中性PH范圍.有機溶劑的污染會影響實驗結(jié)果
- 只能用本試劑盒提供的洗滌液洗板.不充足的洗板會導致錯誤的結(jié)果
- 在吸水紙上拍干去除殘留液滴時,切勿用吸水紙刮擦孔內(nèi)壁
- 顯示劑應避光保存并避免與金屬物質(zhì)接觸
- 加終止液后,30 min內(nèi)就應讀取實驗結(jié)果
結(jié)果計算
所有實驗數(shù)據(jù)(包括標準品,檢測樣品的OD值),都應減去樣品空白對照的OD值.
在log-log坐標紙用,以較正的OD值為縱坐標,相對應的濃度為橫坐標,建立標準曲線. 樣品直接在標準曲線上獲取濃度值.
標準曲線示范
上圖所示典型標準曲線僅用于演示示范,不能用于試驗數(shù)據(jù)的獲取.每次實驗都應建立其標準曲線.
常規(guī)事項
1所有試劑置于2 - 8°C保存.實驗前將試劑平衡至室溫(約30分鐘)
2瓶裝標準品是凍干品,故小心打開瓶蓋
3終止液是強酸物質(zhì).使用時,避免其接觸皮膚和衣膚.
4棄置用過的物質(zhì)前,用水沖洗
5 濃縮酶標抗體,EIA緩沖液和濃縮洗滌液可能會出現(xiàn)沉淀,但這并不會影響實驗
6使用試劑后應洗手
7切勿混用不同批號的試劑
8別使用過期的試劑
9試劑盒僅供研究用,不能用于臨床診斷.
存儲與有效期
存儲條件:2 - 8°C
有效期見試劑盒外包裝
