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技術文章

大鼠白介素1β ELISA試劑盒

閱讀:670發(fā)布時間:2014-7-10

前言簡介
白介素1一類非常重要的具備生物活性單核細胞衍生蛋白,它參與了多種炎癥與免疫反應. 有2種不同的白介素1已經(jīng)被鑒別,分別為白介素1α和白介素1β,它們有相似的分子量,生物功能和相同的受體.白介素1蛋白是由巨噬細胞,單核細胞和各種類型的細胞(如成熟T細胞,纖維母細胞,上皮或內(nèi)皮細胞,中性粒細胞和星形膠質(zhì)細胞)分泌的.它們的生物學特性包括發(fā)熱性,骨吸收,暴露抗原和刺激B和T淋巴細胞增殖.
原理
此試劑盒運用了兩種特異性抗體,洗板后加入TMB底物液顯色,顯色的強度與大鼠白介素1β的量成正比.
 
檢測范圍
11.72 ~ 750 pg/mL
 
預期用途
 
■此IBL試劑盒能用于大鼠血清,EDTA血漿,細胞上清中白介素1β的定量檢測
 
 
試劑盒成分
1  包被板:     抗大鼠白介素1β兔子IgG,親合純化                96T
2  酶標記抗體:
   (30倍濃縮)HRP標記抗大鼠白介素1β兔子IgG,親合純化         0.4mL x 1
3  標準品:           重組大鼠白介素1β                      0.5mL x 2     
4  EIA緩沖液:         含1% BSA, 0.05%吐溫20  BPS                       30mL x 1
5  標記抗體稀釋液:       含1% BSA, 0.05%吐溫20  BPS                  12mL x 1
6  顯色劑:                                 TMB底物液                                                15mL x 1
7  終止液:                                     1N硫酸                                                   12mL x 1
8  濃縮洗滌液:
 (40倍濃縮) 含1% BSA, 0.05%吐溫20  BPS                      50mL x 1
 
 
操作說明
1實驗所需器材(但試劑盒沒有提供)
  酶標儀(450nm)          微移液管及其吸嘴
  量筒及燒杯             蒸餾水
  冰箱(4°C)               坐標紙(log/log)
  吸水紙                 試管(用于標準品稀釋)
  溫育箱(37°C ± 1°C)
  洗瓶(用于洗板)
  一次性試劑管(用于濃縮酶標記抗體和顯色劑)
2準備
 

  1. 洗滌液的準備

試劑盒的洗滌液是一種40倍濃縮液,用1950 mL蒸餾水稀釋50 mL的濃縮洗滌液,制成2000mL即用稀釋洗滌液. 置于冰箱內(nèi)可保存2周.

  1. 酶標記抗體的準備

試劑盒中的標記抗體是一種30倍濃縮物,根據(jù)所需量,用標記抗體稀釋液稀釋30倍.
示例:
如果你用一條板(8孔),就需800  μL.的標記抗體.就用870  μL的標記抗體稀釋液稀釋30  μL抗體濃縮液,充分混勻.并每孔各加100 μL
濃縮酶標記抗體需稀釋后才能用于實驗
剩余的稀釋標記抗體液需密封瓶裝,存于4°C

  1. 標準品的準備

加0.5 mL的蒸餾水到瓶裝標準品,制成濃度為1500 pg/mL大鼠白介素1β標準品液

  1. 標準品的稀釋

準備8支試管,并每支各加230 μL  EIA緩沖液.稀釋成如下濃度,步驟如下圖所示:
試管1                            750 pg/mL
試管2                            375 pg/mL
試管3                                             187.5 pg/ mL
試管4                                             93.75 pg/mL
試管5                                             46.88 pg/mL
試管6                                             23.44 pg/mL
試管7                                              11.72pg/mL
試管8                                   0 pg/mL(樣品空白對照)
吸取230ul的標準品液于1號管混勻,然后從1號管吸取230ul加入2號管混勻,如下圖所示,按此規(guī)律稀釋,第8號管為0 pg/mL作為樣品空白對照

 

  1. 樣品稀釋

 樣品如需稀釋時,必須用EIA緩沖液進行稀釋
 如果樣品中大鼠白介素1β的濃度范圍一無所知的話,預先準備幾個不同稀釋濃度的樣品液來確定*的檢測濃度.
 
 
 
3實驗步驟
使用前,將所有試劑應平衡至室溫,大約30min,充分混勻,確保試劑質(zhì)量無改變,標準曲線和樣品檢測必須同時進行.
 

試劑待檢測樣品標準品樣品空白試劑空白
檢測樣品100ul稀釋標準品(1-7管)100ulEIA緩沖液(第8管)100ulEIA緩沖液100ul
蓋板,于4°C下溫育過夜
洗板7次
酶標抗體100ul100ul100ul-
蓋板,于4°C下溫育30min
洗板9次
顯色劑100ul100ul100ul100ul
室溫避光溫育30min
終止液100ul100ul100ul100ul
加終止液后,30min內(nèi)于450nm處讀取OD值

1)設試劑空白對照,并于相應的微孔中加入100ul EIA緩沖液
2)  確定好樣品空白對照孔,檢測樣品孔和標準品孔,分別將100ul樣品對照品(8號管)、檢測樣品和稀釋好的標準品(1-7號管)加入到相應的微孔中。
3)蓋板,4°C下溫育過夜
4)用洗滌瓶劇烈洗板,再加入稀釋洗滌液,靜置15-30秒,再*倒去孔內(nèi)反應液
重復洗板7次.
zui后在吸水紙上拍干,去除殘留液滴
如用自動洗板機洗板,先自動洗4,再按上述用洗瓶手工洗3
5)除試劑空白對照孔外,其余每孔各加100ul酶標抗體
6)蓋板,4°C下溫育30min
7)按照上述步驟4)洗板9次
8)  用一次性試管取所需量的顯色劑,各加100ul顯色劑于微孔中.為了避免污染,勿將剩余試劑在倒回試劑瓶中
9)室溫避光溫育30min,加入顯色劑后溶液顏色會變成藍色
10)每孔各加100ul終止液,溶液顏色會變成黃色
11)擦去微孔板底部的污跡或水滴,確保微孔內(nèi)溶液無氣泡產(chǎn)生.加入終止液后30min內(nèi)于酶標儀450nm處讀取結(jié)果
 
 
特別注意

  1. 收集樣品后盡快檢測. 如需保存, 凍存樣品,但要避免反復凍融.檢測前,將樣品解凍至室溫.
  2. 如樣品需稀釋,用EIA緩沖液稀釋
  3. 建議樣品,標準品做雙份檢測
  4. 保持樣品處于中性PH范圍.有機溶劑的污染會影響實驗結(jié)果
  5. 只能用本試劑盒提供的洗滌液洗板.不充足的洗板會導致錯誤的結(jié)果
  6. 在吸水紙上拍干去除殘留液滴時,切勿用吸水紙刮擦孔內(nèi)壁
  7. 顯示劑應避光保存并避免與金屬物質(zhì)接觸
  8. 加終止液后,30 min內(nèi)就應讀取實驗結(jié)果

 
結(jié)果計算
所有實驗數(shù)據(jù)(包括標準品,檢測樣品的OD值),都應減去樣品空白對照的OD值.
在log-log坐標紙用,以較正的OD值為縱坐標,相對應的濃度為橫坐標,建立標準曲線. 樣品直接在標準曲線上獲取濃度值.
標準曲線示范

 
上圖所示典型標準曲線僅用于演示示范,不能用于試驗數(shù)據(jù)的獲取.每次實驗都應建立其標準曲線.
 
常規(guī)事項
1所有試劑置于2 - 8°C保存.實驗前將試劑平衡至室溫(約30分鐘)
2瓶裝標準品是凍干品,故小心打開瓶蓋
3終止液是強酸物質(zhì).使用時,避免其接觸皮膚和衣膚.
4棄置用過的物質(zhì)前,用水沖洗
5 濃縮酶標抗體,EIA緩沖液和濃縮洗滌液可能會出現(xiàn)沉淀,但這并不會影響實驗
6使用試劑后應洗手
7切勿混用不同批號的試劑
8別使用過期的試劑
9試劑盒僅供研究用,不能用于臨床診斷.
存儲與有效期
存儲條件:2 - 8°C
有效期見試劑盒外包裝


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