前言簡介
細胞因子誘導中性粒細胞化學趨化因子1（CINC-1）zui初是通過白介素1β刺激大鼠腎上皮細胞（NRK-52E）純化提取的.1989年時,富山醫科藥科大學的Watanabe團隊鑒別出了大鼠CINC-1的氨基酸序列.CINC-1是CXC趨化因子亞族的一員.另外其它幾種大鼠CXC趨化因子（CINC-2α, CINC-2β, CINC-3/MIP-2）的序列也被鑒別出來,大約有63 - 67%的氨基酸序列與CINC-1的相同.此外, GROα, GROβ與GROγ也分別有68%, 71%,69%與CINC-1序列一致.這表明CINCs是人GROs的大鼠相似物.
原理
此試劑盒運用了兩種特異性抗體,洗板后加入TMB底物液顯色,顯色的強度與樣品中大鼠GRO/CINC-1的量成正比.
檢測范圍
4.69 ~ 300 pg/mL
預期用途
■此IBL試劑盒能用于大鼠血清,EDTA血漿,細胞上清中GRO/CINC-1的定量檢測
■重組和天然的大鼠GRO/CINC-1都可以檢測.
試劑盒成分
1 預包被板: 抗大鼠GRO/CINC-1兔子IgG,親合純化 96T
2 酶標記抗體:
（30倍濃縮）HRP標記抗大鼠GRO/CINC-1兔子IgG,親合純化 0.4mL x 1
3 標準品: 重組大鼠GRO/CINC-1 0.5mL x 2
4 EIA緩沖液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 30mL x 1
5 標記抗體稀釋液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 12mL x 1
6 顯色劑: TMB底物液 15mL x 1
7 終止液: 1N硫酸 12mL x 1
8 濃縮洗滌液:
（40倍濃縮） 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 50mL x 1
操作說明
1實驗所需器材（但試劑盒沒有提供）
酶標儀（450nm） 微移液管及其吸嘴
量筒及燒杯 蒸餾水
冰箱（4°C） 坐標紙（log/log）
吸水紙 試管（用于標準品稀釋）
溫育箱（37°C ± 1°C）
洗瓶（用于洗板）
一次性試劑管（用于濃縮酶標記抗體和顯色劑）
2準備
- 洗滌液的準備
試劑盒的洗滌液是一種40倍濃縮液,用1950 mL蒸餾水稀釋50 mL的濃縮洗滌液,制成2000mL即用稀釋洗滌液. 置于冰箱內可保存2周.
- 酶標記抗體的準備
試劑盒中的標記抗體是一種30倍濃縮物,根據所需量,用標記抗體稀釋液稀釋30倍.
示例:
如果你用一條板（8孔）,就需800 μL.的標記抗體.就用870 μL的標記抗體稀釋液稀釋30 μL抗體濃縮液,充分混勻.并每孔各加100 μL
濃縮酶標記抗體需稀釋后才能用于實驗剩余的稀釋標記抗體液需密封瓶裝,存于4°C
- 標準品的準備
加0.5 mL的蒸餾水到瓶裝標準品,制成濃度為600 pg/mL大鼠GRO/CINC-1標準品液
- 標準品的稀釋
準備8支試管,
并每支各加230 μL EIA緩沖液.稀釋成如下濃度,步驟如下圖所示:
試管1 300 pg/mL
試管2 150 pg/mL
試管3 75 pg/ mL
試管4 37.5 pg/mL
試管5 18.75 pg/mL
試管6 9.38 pg/mL
試管7 4.69pg/mL
試管8 0 pg/mL（樣品空白對照）
吸取230ul的標準品液于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管混勻，如下圖所示,按此規律稀釋，第8號管為0 pg/mL作為樣品空白對照
- 樣品稀釋
樣品如需稀釋時,必須用EIA緩沖液進行稀釋
如果樣品中大鼠GRO/CINC-1的濃度范圍一無所知的話,預先準備幾個不同稀釋梯度的樣品液來確定*的檢測濃度.
3實驗步驟使用前，將所有試劑應平衡至室溫，大約30min，充分混勻，確保試劑質量無改變，標準曲線和樣品檢測必須同時進行.
| 試劑 | 待檢測樣品 | 標準品 | 樣品空白 | 試劑空白 |
| 檢測樣品100ul | 稀釋標準品（1-7管）100ul | EIA緩沖液（第8管）100ul | EIA緩沖液100ul |
| 蓋板，于37°C下溫育1小時 |
| 洗板7次 |
| 酶標抗體 | 100ul | 100ul | 100ul | - |
| 蓋板，于37°C下溫育30min |
| 洗板9次 |
| 顯色劑 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
| 室溫避光溫育30min |
| 終止液 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
| 加終止液后,30min內于450nm處讀取OD值 |
1）設試劑空白對照，并于相應的微孔中加入100ul EIA緩沖液
2） 確定好樣品空白對照孔，檢測樣品孔和標準品孔，分別將100ul樣品對照品（8號管）、檢測樣品和稀釋好的標準品（1-7號管）加入到相應的微孔中。
3）蓋板，37°C下溫育1小時
4）用洗滌瓶劇烈洗板,再加入稀釋洗滌液,靜置15-30秒,再*倒去孔內反應液
重復洗板7次.
zui后在吸水紙上拍干,去除殘留液滴
如用自動洗板機洗板,先自動洗4次,再按上述用洗瓶手工洗3次5）除試劑空白對照孔外,其余每孔各加100ul酶標抗體
6）蓋板，37°C下溫育30min
7）按照上述步驟4）洗板9次
8） 用一次性試管取所需量的顯色劑，各加100ul顯色劑于微孔中.為了避免污染，勿將剩余試劑在倒回試劑瓶中
9）室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會變成藍色
10）每孔各加100ul終止液，溶液顏色會變成黃色
11）擦去微孔板底部的污跡或水滴，確保微孔內溶液無氣泡產生.加入終止液后30min內于酶標儀450nm處讀取結果
特別注意
- 收集樣品后即盡快檢測. 如需保存, 凍存樣品,但要避免反復凍融.檢測前,將樣品解凍至室溫.
- 如樣品需稀釋,用EIA緩沖液稀釋
- 建議樣品和標準品做雙份檢測
- 保持樣品處于中性PH范圍.有機溶劑的污染會影響實驗結果
- 只能用本試劑盒提供的洗滌液洗板.不充足的洗板會導致錯誤的結果
- 在吸水紙上拍干去除殘留液滴時,切勿用吸水紙刮擦孔內壁
- 顯示劑應避光保存并避免與金屬物質接觸
- 加終止液后,30 min內就應讀取實驗結果
結果計算所有實驗數據（包括標準品,檢測樣品的OD值）,都應減去樣品空白對照的OD值.
在log-log坐標紙用,以較正的OD值為縱坐標,相對應的濃度為橫坐標,建立標準曲線. 樣品直接在標準曲線上獲取濃度值.
標準曲線示范
上圖所示典型標準曲線僅用于演示示范,不能用于試驗數據的獲取.每次實驗都應建立其標準曲線.
常規事項1所有試劑置于2 - 8°C保存.實驗前將試劑平衡至室溫（約30分鐘）
2瓶裝標準品是凍干品,故小心打開瓶蓋
3終止液是強酸物質.使用時,避免其接觸皮膚和衣膚.
4棄置用過的物質前,用水沖洗
5 濃縮酶標抗體,EIA緩沖液和濃縮洗滌液可能會出現沉淀,但這并不會影響實驗
6使用試劑后應洗手
7切勿混用不同批號的試劑
8別使用過期的試劑
9試劑盒僅供研究用,不能用于臨床診斷.
存儲與有效期存儲條件:2 - 8°C
有效期見試劑盒外包裝
