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河南四海凈水材料有限公司
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閱讀：399發(fā)布時間：2010-9-29
聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作方法。聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰氨凝膠電泳作用：用于分離蛋白質和寡糖核苷酸。 作用原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結構，具有分子篩效應。它有兩種形式：（1）非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。 而SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白質亞基分子量的不同就可以分開蛋白質。該技術zui初由shapiro于1967年建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小（可以忽略電荷因素）。
作用
SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使絆*殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白- SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。 SDS-PAGE一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，于連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比，能夠有較高的分辨率。 濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。當樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/*。電泳開始后，HCL解離成氯離子，*解離出少量的*根離子。蛋白質帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子zui快，*根離子zui慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率zui大，超過蛋白，因此在后面形成低電導區(qū)，而電場強度與低電導區(qū)成反比，因而產生較高的電場強度，使蛋白和*根離子迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。 此鑒定方法中，蛋白質的遷移率主要取決于它的相對分子質量，而與所帶電荷和分子形狀無關。
蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小 和形狀等因素。如果加入一種試劑使電荷因素消除，那電泳遷移率就取決于分子的大小，就可以用電泳技術測定蛋白質的分子量。1967年，Shapiro等發(fā)現(xiàn)陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）具有這種作用。當向蛋白質溶液中加入足夠量SDS和巰基乙醇，SDS可使蛋白質分子中的二硫鍵還原。由于十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白 質—SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質分子原的電荷量， 因而掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別，SDS與蛋白質結合后，還可引起構象改 變，蛋白質—SDS復合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度都一樣，約為18A，這樣的蛋白質—SDS復合物，在凝膠中的遷移率，不 再受蛋白質原的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小由于蛋白質－SDS復合物在單位長度上帶有相等的電荷，所以它們以相等的遷移速度從濃縮膠進入分離膠，進入分離膠后，由于聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質可以容易的通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質在電泳過程中就會根據(jù)其各自分子量的大小而被分離。因而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測定蛋白質的分子量。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳經(jīng)常應用于提純過程中純度的檢測，純化的蛋白質通常在SDS電泳上應只有一條帶，但如果蛋白質是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應于各個亞基的幾條帶。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級的蛋白質，而且通過電泳還可以同時得到關于分子量的情況，這些信息對于了解未知蛋白及設計提純過程都是非常重要的。
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