（1）無菌操作：細菌或霉菌污染是培養(yǎng)失敗的常見原因，必須加強各個環(huán)節(jié)的無菌操作觀念，以預防為主，一旦污染，一般很難消除。
（2）培養(yǎng)液：所用的培養(yǎng)液必須滿足細胞生存和生長的必要條件。由于細胞來源的動物種類、組織類型不同，對培養(yǎng)液的要求有一定的差異，必要時可用預實驗的方法選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)液。
（3）小牛血清：小牛血清對于維持培養(yǎng)細胞的生存和促進細胞增殖起著關(guān)鍵性作用。可選擇多種不同批號的小牛血清進行小樣分析。一旦確定某一廠家的某一批號小牛血清后，就保持應用至實驗完成。
（4）*：必須新鮮配制，貯存時間過長（即使是-20℃低溫保存），也將影響消化效力，導致消化時間過長，細胞損傷增加。
（5）L-*：幾乎所有細胞對*都有較高的要求，細胞需要*合成核酸和蛋白質(zhì)，在缺少*時，細胞會因生長不良而死亡。*在溶液中很不穩(wěn)定，加有*的培養(yǎng)液在4℃冰箱貯存兩周以上時，就應重新加入原來量的*。
（6）靜置培養(yǎng)：原代細胞在消化分離后，置于CO2培養(yǎng)箱的頭24～48h （必要時72h）內(nèi)，應處于靜置狀態(tài)，切忌不時地取出培養(yǎng)瓶觀察生長狀況，這將使原代分離細胞難以貼壁，更談不上伸展和增殖，初學者尤應注意。不必擔心培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分會消耗光，在細胞增殖之前對營養(yǎng)的要求并不大。原代培養(yǎng)初期僅加一薄層培養(yǎng)液的目的也在于有利于細胞貼壁伸展。
（7）消化時間：一般消化至肉眼尚可見微小組織顆粒即可，因為此時組織顆粒已經(jīng)松散，略經(jīng)吹打即成細胞團或單個細胞，過久的消化往往導致細胞損傷加重，細胞培養(yǎng)成活率降低。
（8）其他生長因子：經(jīng)過以上處理，一般原代分離細胞培養(yǎng)均可以成功。對于少數(shù)特殊類型細胞也可以考慮加一些特殊的生長因子，如胰島素能促使細胞攝取葡萄糖和氨基酸。另外，內(nèi)毒素、EGF、FGF等均有促有絲分裂作用，但費用較高。
