[實驗原理]
限制性內(nèi)切酶識別短的DNA序列并在識別序列內(nèi)或旁側(cè)特異性切割雙鏈DNA。對環(huán)狀DNA有多少切口，就能產(chǎn)生多少個酶解片段，因此鑒定酶切后的片段在電泳凝膠中的區(qū)帶數(shù)，就可以推斷酶切口的數(shù)目，從片段的遷移率可以大致判斷酶切片段大小的差別。
DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖—磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。如上次實驗提取的質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA（covalently closed circular DNA，簡稱CCCDNA），開環(huán)質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 1條鏈斷裂，（open circular DNA，簡稱OCDNA），線狀質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 2條鏈發(fā)生斷裂（linear DNA，簡稱L DNA）。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA泳動zui快，其次為線狀DNA，zui慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。
[儀器、材料與試劑]
（一）儀器與材料
恒溫水浴槽、電泳儀、電泳槽、紫外線透射儀、移液槍、質(zhì)粒、HindIII酶、EcoRI酶
（二） 試劑
1 000 mL 5xTBE：Tris 54 g硼酸27.5 g 0.5 mol／L EDTA 20 mL（pH 8.0）
凝膠加樣緩沖液（6x）：溴酚藍0.25％蔗糖40％
瓊脂糖 溴化乙錠溶液（EB） 0.5ug／mL
[實驗步驟]
（一） 酶切
取5uLDNA溶液，加1uL酶切緩沖液，EcoRI酶1uL（2U），無菌水補至總體積10uL，37保溫3h，加凝膠上樣緩沖液（6X）2uL，準備下個實驗進行電泳，分析質(zhì)粒DNA的限制性酶切圖譜。
（二） 瓊脂糖凝膠電泳檢測
1、 制備瓊脂糖凝膠 按照被分離DNA的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。可參照下表：
瓊脂糖凝膠濃度／％ 線性DNA的有效分離范圍／kb
0.3 5—60
0.6 1—20
0.7 0.8—10
0.9 0.5—7
1.2 0.4—6
1.5 0.2—4
2.0 0.1—3
稱取0．3g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入30mL1xTBE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至*溶化，取出搖勻，則為1％瓊脂糖凝膠液。
2、 膠板的制備
將有機玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子；將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液緩緩倒入有機玻璃內(nèi)槽，直至有機玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）；待膠凝固后，取出梳子，并放在電泳槽內(nèi)，加人電泳緩沖液至電泳槽中。
3、加樣
用移液槍將已加入上樣緩沖液的DNA樣品加入加樣孔（記錄點樣順序及點樣量）。
4、電泳
接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負極，DNA片段從負極向正極移動）。DNA的遷移速度與電壓成正比，zui高電壓不超過5V／cm。當(dāng)溴酚藍染料移動到距凝膠前沿1～2cm處，停止電泳。
5、染色
將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染色液中，染色（15min）以觀察在瓊脂糖凝膠中的帶（戴手套操作）。
[實驗結(jié)果]
在紫外燈（360nm，312nm或254nm）下觀察染色后的電泳凝膠。DNA存在處應(yīng)顯出桔紅色熒光條帶。
