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上海酶聯生物研究所
上海酶聯生物研究所
閱讀：357發布時間：2012-9-6
使用蛋白聚集分析試劑盒定量分析蛋白聚集體——優化生物工藝研發的創新性產品
Wayne F. Patton, Ph.D.
Keywords: 聚集、生物工藝、蛋白療法、生物治療
蛋白聚集嚴重影響以蛋白為基礎研發的藥物。在藥物制劑中，蛋白聚集在生物活性和免疫原性方面影響藥效。
蛋白聚集發生在生產過程的各個階段包括細胞培養、純化、生產、儲存、運輸等方面。制藥工業希望在生物工藝中找到新的方法，可用于檢測、追蹤、定量分析影響蛋白聚集的因素。
近年來以凍干穩定形式存在的蛋白聚集體作為標準品，可以準確地定量檢測蛋白聚集，加上新穎的只需在酶標儀里即可實驗的ProteoStat® protein aggregation assay，可對蛋白檢測方法進行優化。
在這篇文章中，使用已知濃度的聚集IgG標準品作為標準曲線，通過ProteoStat® protein aggregation assay/standards對IgG的聚集水平進行檢測，集中分析了制藥工業中常見的3種聚集形式。
熱誘導聚集
機械誘導聚集
冷凍和反復凍融誘導聚集
材料和方法
Enzo Life Sciences 推出了ProteoStat protein aggregation assay 和ProteoStat protein aggregation standards，利用熒光分子信號染料可特異性結合聚集蛋白和多肽，在微孔板中即可檢測。
探針在溶液中是不發出熒光的，當與聚集蛋白的四級結構結合時會發出明亮的熒光。一旦聚集標準品發生重組，它們將含有0-12.5%的聚集蛋白，總蛋白濃度維持在1mg/ml。
通過粒子分析成像鑒定標準品發現90%的蛋白聚集體長度為2-10um，約9%的蛋白聚集體長度為10-20um，約0.7%的蛋白聚集體為長度大于20um。
Synergy™ Mx Multi-Mode Microplate Reader （BioTek Instruments） 可用于所有蛋白聚集分析。它的激發波長為500nm，發射波長為600nm，激發和發射狹縫寬度為9nm，便于檢測ProteoStat染料。Thioflavin T染料可以在激發單色器激發波長為435nm，發射波長為495nm，都在激發和發射狹縫寬度為9nm的條件下進行檢測。
結果
在96孔微板中檢測比較ProteoStat和Thioflavin T染料與蛋白聚集的結合能力。純化的兔抗羊lgG（4.26 mg/ml）在pH2.7的鹽酸水溶液中，80℃溫度下孵育90分鐘后會形成蛋白聚集體。
聚集信號由聚合體和單體混合比例不同決定的，但總的lgG蛋白濃度仍然是60 ug/ml。在50 mM磷酸鉀，pH 7，3uM ProteoStat 檢測試劑或5uM Thioflavin T 染料中讀數。這些濃度在以前做過預實驗，已經確定是*的濃度。
在蛋白和染料一起孵育15分鐘后使用BioTek Synergy Mx Microplate Reader讀數。所用的板為Greiner µClear® black, clear bottom 96-well microplates （Greiner Bio One）。
在相同情況下，ProtesStat染料的熒光強度比Thioflavin T染料高100倍。對于濃度為1.2 ug/ml的聚集體，ProteoStat染料的信噪比為12.8，而Thioflavin T染料的信噪比僅為1.2，表明ProteoStat染料在蛋白聚集檢測中更準確、靈敏度更高。
正因為由此顯著的優勢，ProteoStat protein aggregation assay和ProteoStat protein aggregation standards通常能夠共同用于各種常規形式的蛋白聚集檢測。
監控熱誘導聚集
當蛋白受到提高溫度刺激會加速其聚集。羊lgG（4mg/mL）在各個時期都處于攪拌速度400rmp，100mM磷酸鈉，pH7.2，溫度60℃下。
在每個時間點，25ul lgG用于測量。首先樣本在1x assay buffer中稀釋4倍后，得到的蛋白zui終濃度為1 mg/ml。在每個孔中加入98ul的檢測蛋白和2ul的ProteoStat Detection Reagent Loading Solution，每個時間點都做平行孔。
同時，ProteoStat protein aggregation standards中含有穩定的、高質量的對照樣本，用來做標準曲線。
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