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上海酶聯生物研究所
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閱讀：2309發布時間：2012-8-27
微流體PCR和DNA測序讓我們能夠從大細胞群中挑出單個的細胞進行分析。現在研究人員正在生物學中發現全新水平的復雜性。
數十年來，研究人員一直是對細胞群展開分析。人們認為構成這些細胞群的單個細胞例如干細胞和腫瘤細胞差不多是一樣的，細胞生物學家們采用的方法獲得的都是這些細胞群特征的平均值。
德克薩斯大學MD安德森癌癥中心的遺傳學助理教授Nicholas Navin 說：“當前的方法是整體分析腫瘤，由此報告來自細胞群的平均信號。其缺點在于它可能掩蓋了zui豐富的、也是zui惡性的腫瘤細胞亞群。”
然而現在，隨著微流體PCR和DNA測序技術的進展使得從這些細胞群中分離出和分析單個細胞變得更為容易。而zui讓人驚訝地是，研究人員發現這些細胞并不*相同。事實上，這些細胞群可能是由帶有極其不同藍圖的幾種亞細胞群組成。這一發現可以幫助癌癥研究人員，例如追蹤轉移細胞。現在，科學家們正利用新的單細胞分析技術去發現哪些細胞具有哪些藍圖，以及是如何影響它們的表型的。
揭露干細胞的異質性
在美國斯坦福醫學院，醫學、心臟病學和放射學副教授Joseph Wu正在開發一種集成微流體電路用于單細胞實時PCR。這些設備僅需數皮克的RNA就可在單細胞水平上分析基因表達。利用這種方法，Joseph Wu和同事們揭示了采用常規實時PCR有可能看起來是一致的細胞群的異質性。
“從前，由于實時PCR需要數百至數千細胞的RNA，人們猜想收到相同胞外信號的一個細胞群體會對變化做出反應，具有相同基因表達模式。新微流體設備使得我們能夠在細胞群內逐個細胞研究基因表達，并揭示了對環境反應可能的細胞異質性，”Joseph Wu說
例如，在近期發表的一篇論文中，Joseph Wu和同事們利用單細胞實時PCR微流體設備比較了人類誘導多能干細胞（hiPSCs）和人類多能干細胞（hESCs）的異質性。它們發現相比hESCs在hiPSCs中基因表達水平差異更大，表明一種不穩定的多能狀態。此外，研究小組還發現hiPSCs的分化緩慢且不一致，這有可能會不利于其臨床應用。
使癌癥研究受益
德克薩斯大學MD安德森癌癥中心的遺傳學助理教授Nicholas Navin將隨機抽取單個細胞遺傳信息比喻為如同投票選舉：它給予了你一種對群體多樣性的統計學評估。“我們想在人類腫瘤中描繪出克隆的多樣性，了解這一參數在評估侵襲、轉移、存活和對*的反應中是否具有預測價值。利用單細胞測序我們能夠在腫瘤中重建這些細胞系，并了解突變的年表。”
為了實行這種單細胞分析，Navin實驗室利用了一套系統，包括流式細胞分選單細胞或細胞核、激光捕獲顯微切割、全基因組擴增和新一代測序。“單細胞測序將深遠地改變我們了解復雜的細胞群。例如癌癥的方式。”此外，利用單細胞測序研究人員還能夠用罕見及有價值的樣品例如癌癥干細胞或循環腫瘤細胞來開展研究。“在這種情況下，標準方法將不會有足夠的輸入材料來發揮功能。不過，在這些工具準備進入臨床應用前，仍然需要更多的努力來減少與擴增相關的錯誤。”
在冷泉港實驗室，Navin的前博士后顧問Michael Wigler應用演化的觀點來研究了癌癥形成的遺傳學。研究生Timour Baslan 說：“癌癥研究人員之間有一個共識即腫瘤是通過獲得導致失控性擴增的體細胞突變而進化的。但對于這一進化過程實際發生的機制普遍缺乏了解。我們的理由是，因為自然選擇作用于個體，因此致瘤過程對單細胞發揮了作用，zui終導致了腫瘤群。因此要全面掌握腫瘤演變必須要了解單個細胞。”
Wigler研究小組發現單細胞測序可以生成不同細胞類型的有價值的功能信息。Baslan說：“例如，通過測序來自成對原發和轉移樣品的單個細胞的基因組，我們確定了在原發腫瘤中更密切匹配轉移性腫瘤基因組標記的單細胞基因組。在這個特定的實例中，我們可以推測出這些單細胞的功能是種植轉移性腫瘤。”Wigler研究小組還利用成像技術通過表型鑒別了細胞，進而可以將表型與單細胞基因組信息關聯到一起。
解開DNA發夾
一些可實現單個DNA分子測序的新技術，即所謂的單分子測序也迅速地發展成為了單細胞分析的工具。單分子測序的一個有吸引力之處在于它繞開了擴增，減少了時間、成功和潛在的錯誤。一個例子是ABCD生物物理學實驗室研究主任、巴黎高等師范學校（ Ecole Normale Superieure）生物學和物理學系教授Vincent Croquette及同事們開發的一種DNA發夾測序技術。
他們的發現并非*有意的。“zui初，我們設計了一個實驗用一個發夾來研究DNA復制，”Croquette說。他們利用磁鑷子“解開”DNA發夾，DNA發夾的一端固定在一個表面。另一端在磁珠上。“DNA發夾是對復制叉的zui小的物質，通過磁鑷子可將兩臂拉開。”當用磁力將發夾解開時，互補寡核苷酸能夠與發夾鏈雜交，阻止當拉力減小時發夾再拉上。測量對再拉上的阻礙可使他們鑒別出何時已知的DN片段雜交到了發夾上。通過利用他們的方法以及一種互補寡核苷酸連接的周期循環，這種寡核苷酸延伸了與發夾結構雜交的引物，從而他們能夠獲得一個未知片段的單分子序列。Croquette說：“我們還必須提高它的通量和讀長以使其具有競爭力。原則上，它能夠處理非常小量的材料，它的確具有單分子靈敏度。”
zui終，單細胞測序有可能會在癌癥的診斷和治療中成為重要的臨床和治療工具。Wigler研究小組正與紐約紀念斯隆-凱特琳癌癥中心（MSKCC）的 Howard Scher展開合作，利用臨床試驗中來自患者的樣品。Baslan說：“我們正在繪制患者血液中循環腫瘤細胞的圖譜。從長遠來看，我們的目的是將來自循環細胞的單細胞測序數據與臨床參數關聯起來。”
此外，Wigler研究小組還與俄亥俄州立大學的Lyndsay Harris一起采用單細胞測序作為工具監控了患者腫瘤對治療的反應。Baslan 說：“在未來，有可能會出現更多的應用程序，尤其是更多搜尋患者材料的非侵入性方法。其中一個例子是我們與MSKCC的Larry Norton博士合作，檢測了利用細針抽取研究癌癥基因組圖譜的可能性。我們希望通過以非侵入方式獲得單個癌細胞并繪制出圖譜在不久的將來幫助指導臨床中的治療決策。”
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