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上海酶聯生物研究所
上海酶聯生物研究所
閱讀：209發布時間：2012-8-7
在去年召開的美國微生物學會上，來自明斯特大學的醫學微生物學家Dag Harmsen開始聽到了有關德國大腸桿菌疫情爆發的傳言，這場疫情首先在德國北部地區爆發，感染了至少4000人，奪去了超過50人的生命（德國范圍內），在德國以外的歐洲地區也發現了76名患者。
Harmsen教授在這場疫情中發揮了重要的作用——他們通過將引發此次疫情的O104：H4型腸出血性大腸桿菌與2001年采集自一名溶血性尿毒癥（HUS）體內的O104：H4型腸出血性大腸桿菌進行基因對比后，發現，兩種菌株并非同源，引起此次德國EHEC暴發的O104:H4菌株來自一種腸聚集性大腸桿菌EAEC O104:H4 55989菌株的變異，其中還摻雜了一種目前未知的由志賀毒素產生的O104：H4菌株。
在這一場“戰役”中，Harmsen教授主要采用的就是新一代測序技術，他說，“至今，新一代測序技術已經遍布上百個基因組測序中心”。并且隨著更多更新技術的發展，未來新一代測序技術將發展出下下一代創新技術，為基礎科學與臨床治療提供越來越完善的幫助。近期The Scientist雜志就以“Sons of Next Gen”為題，介紹了目前值得關注的各種新技術。
壓縮數據
各種新型測序技術為我們實驗帶來了高通量測序的方法，為生物醫學研究提供了更加廣闊的研究思路，但是這些新技術也導致了一個日益嚴重的問題——如何處理這些數據。即使是對于更傳統的新一代測序技術，也需要將數據外包給某些基因組研究中心，然后兆兆級別（terabytes）的測序數據又被返回到原實驗室。
“對于許多生物學家而言，這是*次他們需要處理如此大數據量的數據”，來自英國歐洲生物信息學研究所的生物信息學家Ewan Birney說，Birney加入了美國政府主持的國家生物技術信息中心，后者旨在獲取來自的測序數據。
一些研究團隊發展了一些新方法制止數據膨脹，比如Birney和他的同事就研發了一種能比標準壓縮方法小5-50倍，來壓縮數據信息的運算方法。這一系統基于圖像和視頻壓縮方法（就像是YouTube，或者衛星電視），并利用了測序數據高度冗余的特點。
這種算法能將每次閱讀與參考數據進行比對，然后標記出兩者的差別，忽視那些相同的地方，比如說，在一個新完成的人類基因組序列中，與參考人類基因組相比，只有10,000個堿基對分之一存在差異，這樣大部分的數據可以忽略不計。
制藥公司和生物技術公司也在加緊開發基因測序數據共享框架，許多公司還參與了一個非盈利組織：Pistoia Alliance，這一組織創始人Nick Lynch 說，Pistoia Alliance就是希望能完成基因測序數據共享框架。
去年11月，這一組織宣布了Sequence Squeeze挑戰，團隊成員以競爭的方式，力求zui短時間內將一個參考序列壓縮至zui小尺寸。這吸引了許多處理大量研究數據的研究人員，比如計算機科學家，還有天體物理學家，利用他們的知識來解決測序難題。
得勝者是來自Sanger研究院的James Bonfield，他能將原始序列壓縮至一個非常小的大小，而且壓縮和解壓的過程時間都很短。“我們希望（這一技術）能在應用，成為數據處理的一種方法”，Lynch說。
單分子測序
Pacific Biosciences公司在2011年4月向市場推出了他們的一款全新產品：the Single Molecule Real Time （SMRT） 測序儀，這一款儀器與傳統測序儀一樣，也是依賴于熒光標記核苷酸，但是有一點卻不同——SMRT一次只聚焦于一個分子，消減了耗時的擴增步驟。
Pacific Biosciences科學家Eric Schadt解釋道，這一系統能在15萬個小孔（小孔直徑為幾十納米，蝕刻于一種鋁薄膜上）中捕獲單個DNA分子，以及一個DNA聚合酶，然后將四種熒光基團標記的核苷酸加在上面。當DNA聚合酶將核苷酸加到序列上的時候，利用兩種不同波長的激光束掃描每個小孔，與增長DNA鏈匹配的核苷酸就發出熒光，這時精密的成像儀器就能從光激發顏色中識別出加入DNA鏈的特殊核苷酸。“這樣你就能確實觀察到DNA的一個單分子”，Schadt說。
SMRT無需仔細調整多個DNA片段序列——由于錯誤積累，逐漸導致非同步，就可以閱讀非常長的片段，平均可超過3000個堿基對，甚至達到上萬個堿基對。而傳統的測序方法只能達到35-400個堿基對的讀長。
這種測序能力對于來自加州大學戴維斯分校的遺傳學家：西蒙·陳（Simon Chan）來說意義重大，他希望能搞清楚端粒中重復的，迅速進化的DNA是否參與了形態變化。在此前一項研究中，陳博士分析了不同類型序列模式，追蹤了新重復重組出現的時間，但是由于每個序列都很相似，因此很難見短DNA片段，組裝成正確序列，陳博士說，“現在我們采用了長讀長測序，更全面的了解了這些序列，解決了問題。”
但是SMRT的價格并不親民，比較高，這就意味著只有少數幾個大型測序中心能買得起。而且這種儀器的錯誤率也相對比較高，來自Warp Drive Bio的Keith Robison說，“一個run大約會出現15%”，他分析過幾種測序儀的數據。不過由于出錯是隨機出現的，而SMRT讀長很長，因此可以將DNA段前后相連，多做幾次獲得比較的結果，他表示。
Robison認為這種儀器zui有利的應用是在單體型分析方面，因為這種研究需要很長讀長，或者從頭測序，而且發生小錯誤也無關緊要。
無需光的測序
Ion Torrent PGM速度和合適價格標簽的關鍵在于，這種測序儀無需傳統二代測序技術苛刻復雜的光學要求。之前的一些測序儀，比如Illumina的HiSeq，需要熒光標記核苷酸進行DNA段測序，這些系統利用DNA聚合酶構建新鏈，通過激光發生器激發熒光標記核苷酸，采用精密光學原理，檢測信號識別堿基。 相比之下，Ion PGM優勢在于利用了DNA合成過程中，DNA聚合酶添加核苷酸時釋放的氫離子，因此能進行多達百萬，或者更多微孔的DNA擴增片段檢測，然后用四種核苷酸按先后順序覆蓋測序板——先是As，然后是Gs，Ts，zui后是Cs。
如果DNA模板序列上互補核苷酸組裝了上去，就說明序列正確，就會釋放出一個氫離子，通過一個pH感應器就能檢測到，研究人員利用一個半導體感應器就能捕獲這種電壓變化，解析序列。每個核苷酸閱讀過程幾秒鐘就能完成，并且不會受到光學系統的干擾，因此這種測序儀更加便宜，也更有效，Life Technologies市場營銷和業務發展副總裁Maneesh Jain說。
為了能讓成本降低，Life Technologies也在一些生產消費性電子產品的加工廠制造芯片，“這就像是電子產品中的Xbox”，Jain說。
據稱，Ion PGM測序儀由于其簡捷、擴展和快速的特性，應用范圍非常廣泛，是多個應用的理想解決方案。目前可進行微生物和病毒Deovo測序、微生物和病毒重測序、擴增子測序、靶向測序、micro RNA和small RNA測序、甲基化測序、CNV檢測和定量、全基因組測序或者全外顯子組測序驗證、條形碼文庫、末端配對測序、線粒體測序、文庫質控、ChIP-Seq、RNA-Seq、mate-paired 測序。
今年一月，Ion Torrent系列產品又推出了一個更強大的產品：Ion Proton，這款Ion PGM的升級版的測序儀能在一天內完成人類基因組的測序，成本約為1000美元。
不過Ion Torrent也存在局限性，這種儀器在處理重復序列長片段時，可能會出錯，來自Warp Drive Bio的Keith Robison說，他分析了幾種測序儀的數據，他認為由此Ion Torrent很難識別出癌癥基因組中的插入片段，或者刪除片段，這個儀器應用于速度和成本為關鍵因素的實驗。
納米-納米
這是一種與擴增，光學檢測無關的技術，來自英國的Oxford Nanopore公司研發了一種稱為 GridION的測序儀，這個測序系統由數個充滿可任意使用的測試盒（cartridge）的節點構成，每個盒內又包含了多個納米孔。每個GridION 的節點和測試盒，zui初的設計規模都是每天傳輸萬兆字節的數據量。一開始，公司為每個盒內配備2000個納米孔，但zui后還是采用了20個節點，8000個納米孔的配置，這樣才有可能在15分鐘內完整傳輸一個人的基因。
除此之外，Oxford Nanopore公司還推出了一種迷你型測序：MiniON，這種儀器非常小，6小時內可快速測序1.5億對堿基對。它與其他實驗室測試類似，都是利用血液，血漿，和血清進行樣本分析，并且不需要聚合酶鏈反應來進行增幅。該公司將在今年晚些時候開始銷售此設備，定價為900美元（美國價格）。
這個系統采用外切酶測序。基于“芯片上的實驗室”技術，將多個電子元件整合進一個支架狀的裝置。一個蛋白納米孔整合進磷脂雙分子層，位于微池頂部，并配有電極。許多微池被整合入一個陣列芯片，每個模塊控制一個芯片，整合包括用于樣品制備、檢測和分析的液體流動和電子系統。樣品被引入模塊，這個模塊插入一個叫GridION節點的裝置。
每個節點可以單獨使用也可以成簇使用，所有節點間可以實時互相溝通、可以同用戶的網絡系統和存儲系統進行溝通。雖然該平臺的主要用于DNA測序，但它也可以進行調整（對α溶血素蛋白納米孔進行適當調整）而用于蛋白質和小分子的檢測。
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