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1 冷凍管應如何解凍？
取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。

2 細胞冷凍管解凍培養時， 是否應馬上去除DMSO？
除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞)， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

3 可否使用與原先培養條件不同之培養基？
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基， 若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基， 細胞大都無法立即適應， 造成細胞無法存活。

4 可否使用與原先培養條件不同之血清種類？
不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源， 所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6 培養細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？
一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統， 而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養時應使用10 % CO2；當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應使用5 % CO2 培養細胞。

7 何時須更換培養基？
視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數據上之更換時間，按時更換培養基即可。

8 培養基中是否須添加抗生素？
除于特殊篩選系統中外， 一般正常培養狀態下， 培養基中不應添加任何抗生素。

9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？ 一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于-20 °C，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會。

10 懸浮性細胞應如何繼代處理？
一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養液太多時， 可將培養角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶， 加入新鮮培養基稀釋至適當濃度， 重復前述步驟即可。

11 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？
欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過高之轉速， 將造成細胞死亡。

12 細胞之接種密度為何？
依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

13 細胞冷凍培養基之成份為何？
動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。

14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？
冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無菌狀況， *次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C， 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。

15 冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘＊) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。 冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至-80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。＊-20 °C 不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。

16 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？
冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

17 應如何避免細胞污染？
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之方法。

18 如果細胞發生微生物污染時，應如何處理？
直接滅菌后丟棄之。

19 支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株， 無法以其外觀分辨之。

20 支原體污染會對細胞培養有何影響？
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數， 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。

21 偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理？直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。

22 CO2 培養箱之水盤如何保持清潔？
定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

23 為何培養基保存于4 °C 冰箱中， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？
培養基保存于4 °C 冰箱中， 培養基內之CO2 會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調整pH 值。

24 各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？
不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細胞沒有太大之影響， 惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。

25 購買之細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少之情形？
研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少， 大都是因為離心過程操作上的失誤， 造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心， 應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。

26 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？
研究人員在細胞培養時出現存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于-80 °C 太久。

27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用*小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊。

細胞培養知識(二)
無菌操作基本技術
1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70% ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70% ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。
2. 無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70% ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之*無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操作。
3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當等級之無菌操作臺(至少Class II)。操作過程中，應避免引起aerosol 之產生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項目： 5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力 5.2. CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。 5.3. 無菌操作臺內之airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(300小時/預濾網，3000 小時/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。

實驗用品
1. 種類?
1.1. 細胞培養實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無菌制品。
1.2. TC 級培養盤表面均有coating 高分子物質以讓細胞吸附，培養容器種類有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等，依實驗需要使用。
1.3. plastic sterile pipet: 1ml, 2ml,5ml, 10ml, 25ml
1.4. 塑料離心管: 15ml, 50ml，均有2 種不同材質，其中polypropylene (PP) 為不透明材質，polystyrene (PS) 為透明材質，可依實驗需要而選擇適合材質之離心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養液等。
1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100ml, 250ml,500ml,1000ml
2. 清洗? 2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數小時，洗凈后才開始使用。 2.2. 用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。
3. 滅菌?
3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘，置于oven 中烘干。
3.2. 實驗用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170℃, 4 小時。
3.3. 液體或是固體廢棄物可用10% hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘處理。

培養基
1. 液體培養基貯存于4℃冰箱，避免光照，實驗進行前放在37℃水槽中溫熱。
2. 液體培養基(加血清) 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。
3. 粉末培養基配制(以1 升為例)：
3.1. 細胞培養基通常須添加10% 血清，因此粉末培養基之配制體積為900ml，pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養基中會造成pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養基及NaHCO3 粉末應分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調整pH，而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH)，因為氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養基的pH 易發生改變。 3.2. 材料：
3.2.1. 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質非常重要)
3.2.2. 粉末培養基
3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)
3.2.4. 電磁攪拌器
3.2.5. 無菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜
3.2.7. pH meter
3.2.8. 真空幫浦
3.2.9. CO2 氣體
3.3. 步驟：
3.3.1. 取粉末培養基溶于700ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末(數量依培養基種類而異，表一)溶于200ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養基中混合。混后溶液之pH應為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調整之。若為太堿，可再通入CO2 氣體調整pH。培養基以真空幫浦通過過濾膜時，pH 會升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養基種類、日期、瓶號等，貯存于4℃。(血清亦可加入培養基中一起過濾)
3.3.5. 配制之培養基配制須作生長試驗與污染測試。
4. 配制培養基之生長測試
4.1. 材料：
4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10% Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)
4.2. 步驟：
4.2.1. 以待測試培養基培養MDCK cell，接種MDCK 細胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每個well 接種1 × 102 活細胞，同時作對照組實驗。
4.2.2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。 4.2.3. 去除培養基，加入1ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸? 3:1)，室溫下靜置10 min。
4.2.4. 去除固定液，水洗二次。
4.2.5. 加入1ml 10% Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液，水洗二次。
4.2.7. 以肉眼計數群落數，并比較之，若新配制或新批號的培養基對細胞生長不佳，則丟棄之。

細胞培養知識(三)
如何選用特殊細胞系培養基？
培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始，各種目的無血清培養AIM V(12005)培養基(SFM)。

L-*在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？
L-*在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L-*可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-*在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有zui終定論。L-*的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

GlutaMAX-I是什么？培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？
GlutaMAX-I 二肽是一個L-*的衍生物，其不穩定的alpha-氨基用L-*來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-*供利用。 GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有zui小的降解，如果在相同條件下，L-*幾乎*降解。

什么培養基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，(特別是雌激素)。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。 酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，(特別是雌激素)。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。 如何用臺盼蘭計數活細胞？ 用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200～2000個/毫升，在0.1毫升的細胞懸液中加入0.1毫升的0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數分鐘后，用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。

如何消除組織培養的污染？
當重要的培養污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。 高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如*和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。 1. 在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。 2. 分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，*推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。 3. 每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。4. 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2～3代。 5. 在無抗生素的培養基中培養細胞一代。 6. 重復步驟4。 7. 在無抗生素的培養基中培養4～6代，確定污染是否以已被消除。

培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？
丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

細胞培養知識(四)
1.如何選用培養基？
培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養，各種目的無血清培養的是AIM V培養基(SFM)。

2.為什么要熱滅活血清？
加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。

3.L-*在細胞培養中重要嗎？
它在溶液中不穩定嗎？ L-*在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L-*可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-*在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有zui終確定。L-*的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I是什么？
培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？ GlutaMAX-I二肽是L-*的衍生物，將其不穩定的α-氨基用L-*來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-*供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有zui小的降解，如果在相同條件下，L-*幾乎*降解。

5.為什么培養基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。

6.如何用臺盼蘭計數活細胞？
用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200-2000個/毫升，在0.1毫升的細胞中加入0.1毫升的0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數分鐘后，用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。

7.如何消除組織培養的污染？
當重要的培養污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如*和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。
1)在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。
2)分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，*推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3)每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。
4)確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2-3代。
5)在無抗生素的培養基中培養細胞一代。
6)重復步驟4。
7)在無抗生素的培養基中培養4-6代，確定污染是否以已被消除。

8.培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？
丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源。盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

9.Hank’s *(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么？
Hank’s *(HBS)和Earle’s*(EBS)有什么本質的功能差別？ HBS和 EBS 的主要差別在于*的水平，*的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。*需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執行的所有的標準檢驗程序，而且除了這些標準檢測，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測：End-Point Determination of Endotoxin Content噬菌體檢驗生物化學檢測 激素的檢測血紅蛋白檢測Sf9 細胞生長促進及方法學檢測

11.二價離子抑制*活性嗎？使用*時加入EDTA的目的是什么？
二價離子的確抑制*活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制*的活性。建議*處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。

12.制備 lipid-DNA的方法會影響轉染效率嗎？
是的。對于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中，稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中。混合兩種溶液在室溫下孵育15分鐘。對于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復合物在沒有血清的情況下形成。孵育15分鐘后，在復合物中加入含有血清的培養基(800μl)。(注意以上是35mm培養皿使用體積)。對于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應該在與脂質體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個很小的體積下混合DNA和脂質體，接下來可以不需要換培養基的情況下直接加入。

13.我使用SF900 Ⅱ時，細胞生長良好，但是為什么我的蛋白產物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好？
如果目的蛋白是一個后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達，這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產品保持完好。在無血清配方中，蛋白酶作用的*底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清(少于1％)，讓血清給蛋白酶提供作用底物。

14.如何檢測內毒素(熱源)水平？
LAL(Limulus Amebocyte Lysate)試驗是可用的zui敏感和特異的檢測細菌內毒素的方法。Levin和Bang 發現細菌可引起鱟(Limulus polyphemus)血管內的凝集作用。內毒素啟動一個細胞內酶原系統(*蛋白酶級聯反應系統)，通過修飾凝集素，產生一種透明的膠，LAL中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質。LAL試劑緩沖的鱟(血細胞)裂解物。胎牛血清的內毒素檢測是在Grand Island，按照手冊上Gel-clot 方法進行的。在對血清產品進行內毒素檢測前，用無熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘，以消除抑制劑。(通常，血液中的內毒素結合成份的出現會抑制凝膠過程，使內毒素不能與LAL反應。樣品預先熱處理可以消除這種抑制作用。)

15.我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養基嗎？
如果使用固體形式的培養基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應該避免MS培養基的直接滅菌，應該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養基中。

16. 20℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎？
對于普通使用的緩沖液，PH值隨溫度變化而變化。下表列出溫度改變10℃時，PH值的變化情況例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時PH值為 7.4-(2x0.310)＝6.7817. 室溫下(25℃)配制的

17.Tris-HCl溶液，在37℃使用時PH值是多少？
緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同的PH值。

18. 昆蟲細胞培養的zui適PH值和滲透壓是多少？
生長培養基的PH值對細胞的增值和病毒或重組蛋白的生產均會產生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細胞系，在PH值 6.0-6.4范圍的大部分應用效果良好。培養鱗翅類昆蟲細胞系時，培養基的zui適滲透壓是 345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細胞培養方式，減少技術問題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內。

19. High Five細胞有任何其它名稱嗎？
High Five細胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

20.在High Five無血清培養基中去污劑的濃度是多少？
High Five無血清培養基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。

21.High Five細胞用多大的密度凍存？
3.0x10E6 cells/ml

22.在我的果蠅培養基中發現形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對我的細胞有害嗎？
可能是*沉淀，但是更可能是L-*沉淀。培養基中*的濃度比典型的2mM高6倍。*的濃度比在RPMI 1640中高25倍，而且比*更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養條件下可以溶解，對實驗不會有不利的影響。

23.如何從T25瓶中轉移sf9細胞？能用*消化嗎？
我們強力推薦使用脫落細胞的方法，因為這項技術破壞性zui小，生活力zui高。通過使用巴氏德吸液管，讓細胞上培養基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在必要的情況下，才使用*消化細胞。*消化一個T25瓶的sf9細胞：1)去除培養基。2) 用2ml 1xPBS(足以覆蓋細胞表面)洗滌細胞，去除PBS.3) 加入2ml 1x*EDTA(恰好覆蓋細胞表面)。4) 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。5) 向細胞中加入2ml 細胞培養液，移入錐形管，用2ml培養液洗瓶壁，移入同一錐形管中。(培養基中的FBS終止了*的活性。)6) 離心(1100rpm)沉淀細胞。去除培養基。7) 用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。 24.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時，肝素的使用量是多少？ 為了防止懸浮培養細胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。 25.如何評估ES細胞合格的胎牛血清？ 使用D3 ES細胞。這是一個對于胎牛血清中生長促進、生長抑制和分化因子非常敏感的細胞系。相關生長效率分析：當ES細胞以非常低的密度傳入包含10％胎牛血清的生長培養基中，檢測開始和支持ES細胞克隆的能力。細胞毒分析：當以非常低的密度傳入包含30％胎牛血清的生長培養基中，檢測ES細胞和feeder細胞的生長能力。相關形態學和分化分析：檢測胎牛血清支持未分化ES細胞克隆的能力。通過堿性磷酸酶活性評估分化程度。未分化的ES細胞小顏色深紅粉紅，分化的細胞較大，豐滿，顏色較淺。所有的分析在沒有ESGRO的情況下進行的，培養基中出現ESGRO會掩蓋由胎牛血清所導致的問題。(ESGRO或LIF經常用來保持ES細胞處于未分化狀態。)經過培養發現，大約8批中有1批可以用來培養ES細胞。

26.在重新凍存sf9細胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數的增加，它的感染能力會降低嗎？
通常情況當細胞經過30次傳代后，應該返回凍存。無論什么時候記數時，都應該檢查細胞活力。如果超過95％的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。