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上海酶聯生物研究所
上海酶聯生物研究所
閱讀：359發布時間：2011-12-26
一．實驗目的
學習一種人工合成模擬過氧化物酶的方法，了解柱子型固定酶的原理以及感性認識酶分析法的一些應用。
二．實驗原理
過氧化物酶的輔基是血紅素。在體外將血紅素與牛血清白蛋白結合制備成含血紅素的蛋白質分子作為模擬過氧化物酶。在確定血紅素與牛血清白蛋白結合后，檢測其的過氧化物酶活性。然后將此人工模擬酶固定在載體瓊脂糖凝膠（Sepharose 4B）上并裝柱，應用于檢測樣品中痕量過氧化氫的含量，因為過氧化氫的測定不論是在臨床生物化學還是在環境化學和
食品工業中都具有重要意義。
血紅素是一活性分子，而血清白蛋白具有*吸附能力，所以兩者能結合。由于含有血紅素，該結合物就具有過氧化物酶的特性。瓊脂糖凝膠在激活后能很好的吸附蛋白質分子從而把蛋白質分子（模擬過氧化物酶）固定。過氧化物酶能極敏感的催化過氧化氫分解從而使鄰苯二胺變成有色物質2，3-二氨基吩嗪，反應如下：
產物2，3-二氨基吩嗪在428nm處有光吸收峰，所以能以此反應來測定過氧化物酶的活性和檢測過氧化氫的含量。
三．主要儀器與試劑
儀器： 紫外-可見分光光度計，搖床，水浴鍋，天平，布氏漏斗，恒流泵等。
試劑： 氯化血紅素、牛血清白蛋白，過氧化氫，鄰苯二胺，氨水，環氧氯丙烷，Sepharose 4B，1，4-二氧六環等。
四．操作步驟
1．以等摩爾數將牛血清白蛋白與氯化血紅素結合
稱取3.216g 牛血清白蛋白于少量水中溶解，后加水至約30ml。先用幾滴氨水使0.0312g氯化血紅素溶解，加少量水攪勻，然后在攪拌中緩慢滴至30℃的牛血清白蛋白溶液中，zui后使混合液zui終總體積為80ml。其中所含氯化血紅素和牛血清白蛋白的zui終濃度均為0.6mmol/L。在30℃水浴中20 分鐘（以上全班只做兩份）。該混合液經吸收光譜測定確認牛血清白蛋白與血紅素結合后，稀釋4 倍，以稀NaOH或稀HCl調pH 約為9.5。每組取16ml備用。
2．載體Sepharose 4B的活化
將適量的Sepharose 4B于燒結漏斗中（抽氣過濾）抽干，稱取8g（濕重），以100ml 1mol/LNaCl和100ml蒸餾水先后在漏斗上洗滌，抽干后移至小三角瓶內，加入6.5ml 2mol/L NaOH、1.5ml 環氧氯丙烷、15ml 56% 1，4－二氧六環，于40℃的恒溫搖床中振搖活化2h后取出，在燒結漏斗中以蒸餾水和0.2mol/L，pH9.5 Na2CO3-NaHCO3 緩沖液洗滌、抽干。
3．模擬過氧化物酶與載體的連接
將10ml 牛血清白蛋白-氯化血紅素復合物（其余6ml 用作酶活力和偶聯率的測定）與活化的載體Sepharose 4B混合，在40℃搖床上振蕩偶聯24h 左右，在燒結漏斗中收集濾液，并用少許蒸餾水淋洗一并收集，量體積，用作未結合模擬酶的量的測定，算出偶聯率。將偶聯復合物用0.2mol/L，pH9.5 Na2CO3-NaHCO3 緩沖液浸泡后裝柱。用相同緩沖液平衡。
4．模擬酶固定前活力的測定及固定后的應用
固定前酶活力的測定：將2ml 20mmol/L鄰苯二胺與定量模擬酶（如可以是5、10、15μl等）混合后，再與1ml 20%過氧化氫混合，即用時間掃描測定反應0.5 或1 分鐘時428nm處的吸光度，以O.D 值/分.mg酶來表達酶的活力。
固定裝柱后對過氧化氫檢出值的測定：將柱子柱面上平衡液放至界面，把3ml 20mmol/L鄰苯二胺與含微量過氧化氫（如2μl）的水樣品1ml 混合，用恒流泵以0.5ml/min的流速使
樣品經過柱子（洗脫液用0.2mol/L，pH9.5 Na2CO3-NaHCO3 緩沖液），收集有色過柱液3ml并測428nm 的吸光值，以水代替過氧化氫與鄰苯二胺混合過柱作為對照。改變過氧化氫含量重復以上操作，測定出過氧化氫的zui低檢出值。以過氧化氫含量與OD 值的關系作出標準曲線，也可測定污水或雨水中過氧化氫的含量（注意相同條件才能比較）。
5．載體與模擬酶偶聯率的測定
以1 克Sepharose 4B 偶聯模擬酶的毫克數表示。測定模擬酶與載體混合前還原態（加少許連二亞硫酸鈉使模擬酶還原）模擬酶在577nm 的吸光值（已知模擬酶的量），再測定偶聯后未結合的還原態模擬酶在577nm處的吸光值，通過比例法算出未結合模擬酶的數量，從而算出偶聯率。
附：主要物質的分子量
牛血清白蛋白：66，411
氯化血紅素：652
模擬過氧化物酶：67，063
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