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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
經(jīng)營(yíng)模式：生產(chǎn)廠家
商鋪產(chǎn)品：4010條
所在地區(qū)：上海上海市
聯(lián)系人：采購(gòu)部 （經(jīng)理）
閱讀：572發(fā)布時(shí)間：2011-10-10
細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19的檢測(cè)等。
操作過(guò)程：
（1）直接法：
細(xì)胞→3％多聚甲醛固定和 滲透化→封閉→熒光素標(biāo)記的抗體→ 洗滌→熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析
（2）間接法：
細(xì)胞→3％多聚甲醛固定和滲透化→封閉→針對(duì)蛋白的特異抗體→洗滌→熒光素標(biāo)記的二抗→洗滌 → 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞計(jì)分析
凋亡相關(guān)蛋白TFAR19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析
TFAR19（PDCD5）是由本研究室在上首先報(bào)導(dǎo)的一個(gè)擁有自己知識(shí)產(chǎn)權(quán)的人類(lèi)新基因，前期的功能研究表明，它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)劑。利用熒光素（FITC）標(biāo)記的TFAR19單克隆抗體為探針，對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程中TFAR19蛋白的表達(dá)水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19表達(dá)水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰*（PS）外翻和細(xì)胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉(zhuǎn)位是細(xì)胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進(jìn)一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細(xì)胞凋亡早期均出現(xiàn)TFAR19高表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。這為研究細(xì)胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提供了一種新的技術(shù)和指標(biāo)。
1 懸浮細(xì)胞的染色：
（1）收獲正常和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞（0.5~1×106），PBS洗2次，
（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，
（4）加入200ml胎牛血清，室溫反應(yīng)30min。
（5）加入 FITC標(biāo)記的TFAR19單抗，4°C反應(yīng)30min
（6）熒光細(xì)胞洗液洗2次，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。同時(shí)用流式細(xì)胞計(jì)定量檢測(cè)TFAR19蛋白的平均熒光強(qiáng)度。
2：貼壁細(xì)胞的原位染色
（1） 貼壁生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期細(xì)胞鋪在24孔或6孔板中（內(nèi)有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長(zhǎng)，待長(zhǎng)到50%~80%滿(mǎn)時(shí)，凋亡誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞。
（2） 將不同時(shí)間點(diǎn)處理的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，染色步驟同上。
（3） 將染色的爬片細(xì)胞放于一張滴有少量甘油（5ul）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TFAR19在細(xì)胞中的定位。
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